張小千，李劼

（石河子大學動物科技學院，石河子 832003）

牛乳中的抗生素殘留會嚴重威脅人體的健康，有關牛乳中抗生素含量的檢測已成為食品安全的研究熱點之一[1]。因此，開展牛乳中抗生素殘留快速檢測方法的研究顯得尤為重要[2]，目前，國外常用的檢測方法有生物法、色譜法、免疫分析法、分子印跡技術[3]等，按照GBT4789.27-2008規(guī)定[4]，嗜熱鏈球菌抑制法（簡稱TTC法）是我國鮮牛乳中抗生素殘留檢測的標準推薦方法[5]，其原理是嗜熱鏈球菌在牛奶中生長會使無色透明的2,3,5-氯化三苯基四氮唑（TTC）還原為紅色的三苯甲臜[6]，當牛奶中抗生素含量超過一定限度時，會抑制嗜熱鏈球菌的生長，使得牛奶中加入的TTC無法被還原，繼而達到檢測效果。嗜熱鏈球菌抑制法具有簡便、靈敏、價廉等優(yōu)點，并可以檢測多種抗生素，目前應用廣泛[7]。

嗜熱鏈球菌抑制法中使用的指示菌為嗜熱鏈球菌[8]，根據(jù)GBT4789.27-2008，該方法中菌液在牛奶中的培養(yǎng)溫度為36±1℃[9]。但是在實際操作中在該溫度下加入指示劑后并不能很好地觀察到檢測結果，易出現(xiàn)假陰性現(xiàn)象。本試驗將實驗牛奶在六種不同的溫度下培養(yǎng)，以確定嗜熱鏈球菌抑制法的最適檢測溫度，為進一步完善國標的檢測方法、增加嗜熱鏈球菌抑制法的可操作性提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源

試驗所用嗜熱鏈球菌提取自中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司，由本實驗室保存。

1.1.2 儀器

隔水式恒溫培養(yǎng)箱，北京市永光明醫(yī)療儀器廠；高速離心機，德國Hettich公司；電熱恒溫水浴鍋，海申生科技有限公司；LX220A電子天平，瑞士普利賽斯公司；HVE-50高壓滅菌器，HIRAYAMA公司；潔凈工作臺，蘇州安泰空氣技術有限公司。

1.1.3 樣品與試劑

生鮮乳，購自石河子大學某小區(qū)；卡那霉素，成都乾坤動物藥業(yè)有限公司生產；2,3,5-三苯基氯化四氮唑，華東師范大學化工廠產品；蛋白胨，北京奧博星生物技術有限責任公司產品；酵母浸粉，北京奧博星生物技術有限責任公司產品；葡萄糖，西安化學試劑廠產品；磷酸氫二鉀，上海化學試劑分裝廠產品；吐溫-80，上?；瘜W試劑廠產品；西紅柿汁為自制。

1.1.4 培養(yǎng)基

乳酸液體培養(yǎng)基：酵母浸粉7g，蛋白胨7.5g，葡萄糖10g，磷酸氫二鉀2g，10%吐溫-80 0.5mL，西紅柿汁50mL，蒸餾水950mL。

1.2 方法

1.2.1 嗜熱鏈球菌的活化

將在安瓿管中保存的凍干嗜熱鏈球菌用乳酸菌液體培養(yǎng)基洗入試管中，在恒溫箱內49±1℃培養(yǎng)24～36h。

1.2.2 嗜熱鏈球菌的增殖

將活化后的嗜熱鏈球菌接種于乳酸固體培養(yǎng)基，放入溫箱，49±1℃培養(yǎng)12～24h。

1.2.3 嗜熱鏈球菌使用液的制備

將乳酸菌固體培養(yǎng)基上的菌落，用無菌水洗入1.5mL EP管中，以5 000r/min離心10min，然后傾掉上清液，稱取重量，EP管中沉淀菌用無菌水洗入試管，再對EP管稱量，計算菌重，試管中菌量稀釋為1mg/mL，待用。

1.2.4 溫度對嗜熱鏈球菌生長影響試驗

1.2.4.1 平板劃線

將上述稀釋好的菌液振蕩搖勻，用無菌接種環(huán)取一環(huán)劃線培養(yǎng)，在37±1℃、40±1℃、43±1℃、46±1℃、49±1℃、52±1℃下接種兩塊平板，分別于12h、24h后觀察菌落生長情況。

1.2.4.2 菌落計數(shù)

將使用液進行10倍梯度稀釋，作5個稀釋度，即1、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5倍的稀釋，然后吸取10-3、10-4、10-5稀釋度的菌液1mL加入平皿中，每個稀釋度做4個平皿，2個1組，共2組，分別于不同的溫度中培養(yǎng)12h和24h，觀察記錄。

1.2.5 溫度對TTC法檢測結果影響試驗

1.2.5.1 生鮮乳的處理

將購買的新鮮牛奶分為兩份，一份加入卡那霉素（在樣品中含量為5IU/mL）做陽性對照。將兩份牛奶分別加入試管，每管加入4.5mL，做好標記，然后放入恒溫水浴鍋中80℃滅菌20min后從鍋內取出，冷卻到37℃以下備用。

1.2.5.2 培養(yǎng)溫度設置與觀察

取加樣試管，在每管中加入0.5mL使用菌液，置于溫箱，分別在37±1℃、40±1℃、43±1℃、46±1℃、49±1℃、52±1℃下培養(yǎng)，每個溫度分別培養(yǎng)1h、1.5h、2h后，加入TTC指示劑，每30min觀察一次結果，共觀察記錄兩次。

2 結果

2.1 嗜熱鏈球菌劃線平板的生長情況

嗜熱鏈球菌劃線平板生長情況見圖1。

圖1 不同培養(yǎng)溫度、時間嗜熱鏈球菌劃線平板生長情況

由圖1可以看出，當嗜熱鏈球菌培養(yǎng)溫度為37±1℃、40±1℃時，培養(yǎng)基上菌落生長數(shù)量略低；培養(yǎng)溫度為43±1℃、46±1℃、49±1℃、52±1℃時，菌落生長情況較好；培養(yǎng)溫度在49±1℃時，菌落生長情況優(yōu)于其他溫度。

2.2 嗜熱鏈球菌菌落計數(shù)結果

表1 不同溫度下菌落生長結果 單位：cfu

從表1可知，當培養(yǎng)溫度在37℃時，菌落總數(shù)平均為1.6×102；培養(yǎng)溫度在40℃時，菌落總數(shù)平均為8.1×102；培養(yǎng)溫度在43℃時，菌落總數(shù)約為1.7×103；培養(yǎng)溫度在46℃時，菌落總數(shù)約為2.3×103；培養(yǎng)溫度在49℃，菌落總數(shù)約為3×103；培養(yǎng)溫度在52°C時，菌落總數(shù)約為2.5×103；可見溫度在49°C時菌落生長情況最好，菌落總數(shù)最多。

2.3 不同溫度下TTC法檢測結果

表2可以看出，6個實驗溫度組中加抗牛奶在各溫度下加入指示劑均未變色；當嗜熱鏈球菌培養(yǎng)溫度在37±1℃時，加入指示劑后都沒有顏色變化，可見在該溫度時TTC法無法進行檢測；當嗜熱鏈球菌培養(yǎng)溫度在40±1℃的時候，加入指示劑1h后出現(xiàn)顏色變色，但在相同時間變色程度不佳，TTC法檢測觀察不明顯；當嗜熱鏈球菌培養(yǎng)溫度在43±1℃、46±1℃、52±1℃時在相同時間中變色效果較好，且46±1℃＞52±1℃＞43±1℃，但觀察結果沒有達到預期要求；當嗜熱鏈球菌培養(yǎng)溫度在49±1℃時在相同時間內變色效果最好，在培養(yǎng)1.5h后加入指示劑反應30min已經變?yōu)榧t色，其變色效果達到預期要求。

3 討論

TTC法具有操作簡便、價格低廉、易于開展應用等特點，在我國已廣泛使用。本試驗通過在不同溫度下的嗜熱鏈球菌抑制試驗，對嗜熱鏈球菌抑制法做了進一步改進。TTC法常用于檢測的抗生素為卡那霉素（最低檢出限為5IU）、青霉素（0.04IU）、鏈霉素（0.5IU）、慶大霉素（0.4IU），由于檢測卡那霉素的最低檢出限為5IU，在加入牛奶中更有利于攪拌均勻，提高實驗準確性，所以本試驗選擇卡那霉素作為加抗對照；同時，本試驗采用稱重法制備嗜熱鏈球菌使用液，與普通稀釋法相比，稱重法操作簡便，快速，易保持細菌活性，適于TTC法操作過程中對指示菌進行定量。

表2 TTC法檢測結果

本試驗確定在49±1℃時菌落生長情況最好，變色效果最佳，有利于觀察檢測結果，符合國家標準要求，提高了該方法檢測的準確性。本試驗結果完善了乳品安全國家標準，對促進我國乳品行業(yè)健康發(fā)展起到有益作用。