帥 煜，馮光勇，吳明娜，何國平，茍小霞，張貴海

(遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤醫(yī)院 頭頸部科，貴州 遵義 563099)

鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma ,NPC)是發(fā)生在鼻咽腔頂側(cè)壁的惡性腫瘤，在東南亞尤其是中國南方較為常見，其發(fā)病率和死亡率在頭頸惡性腫瘤中居首[1]。近年，鼻咽癌的局控率雖得到較大的提高，但仍有10%～36%鼻咽癌患者經(jīng)適形調(diào)強放療(Intensity-modulated radiation therapy，IMRT)±化療后出現(xiàn)局部和(或)區(qū)域復(fù)發(fā)，其機制極其復(fù)雜[2]。轉(zhuǎn)錄激活因子5(Activating transcription factor 5 ， ATF5)屬于轉(zhuǎn)錄因子ATF/CERB家族成員之一，涉及細胞存活、凋亡、自噬、分化等多種生物功能調(diào)節(jié)及腫瘤發(fā)展過程，在腦膠質(zhì)瘤、乳腺癌、肺癌等腫瘤中呈高表達，且與腫瘤細胞的存活、遷移及放療抵抗等有關(guān)[3]。我們曾研究發(fā)現(xiàn)，鼻咽癌組織ATF5蛋白表達水平與鼻咽癌臨床分期呈負(fù)相關(guān)[4]，但其在復(fù)發(fā)鼻咽癌組織中的表達及臨床意義尚不清楚。因此，筆者通過比較6例同一初發(fā)和復(fù)發(fā)鼻咽癌患者組織ATF5蛋白的表達水平差異及觀察X線對鼻咽癌HONE-1細胞ATF5蛋白表達水平的影響，探討ATF5表達水平與復(fù)發(fā)鼻咽癌的相關(guān)性及其可能機制，為預(yù)測鼻咽癌復(fù)發(fā)提供一定參考價值。

1 材料與方法

1.1 病例資料 收集本院病理科2010年8月至2018年1月保存的6例鼻咽癌患者初發(fā)和復(fù)發(fā)鼻咽癌組織病理標(biāo)本和6例鼻咽部正常組織病理石蠟標(biāo)本。所有組織標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定液固定，常規(guī)石蠟包埋，本次實驗行4 μm連續(xù)切片5張待用。所有鼻咽癌標(biāo)本均經(jīng)病理證實為鼻咽癌，初發(fā)病例確診前均未行任何治療，復(fù)發(fā)病例確診前均行規(guī)范治療。

1.2 細胞 低分化鼻咽癌HONE-1細胞株由中山大學(xué)腫瘤防治中心惠贈。

1.3 主要試劑 兔抗人ATF5單克隆抗體購自美國Abcam公司；兔SP免疫組化試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒、異硫氰酸熒光素、DAPI購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；蘇木素、抗體稀釋液購自北京索萊寶科技有限公司；RPMI 1640培養(yǎng)液購自美國Hyclone公司。

1.4 細胞培養(yǎng) 細胞采用貼壁培養(yǎng)，HONE-1細胞在37 ℃、5%CO2及含10%胎牛血清、1%雙抗(100 U/mL青霉素、100 U/mL 鏈霉素)RPMI 1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)。采用直線加速器6 MV X射線2Gy/5f/W照射細胞(源皮距為100 cm，照射野大小為 25 cm×25 cm，培養(yǎng)板或瓶覆蓋1.5 cm補償膜)，存活的細胞繼續(xù)培養(yǎng)至穩(wěn)定傳代再行X射線照射，如此反復(fù)，分別獲得10Gy/1W、20Gy/2W、30Gy/3W、40Gy/4W、50Gy/5W HONE-1細胞株，穩(wěn)定傳代培養(yǎng)后進行試驗。

1.5 免疫組織化學(xué)染色 將備好鼻咽癌組織切片脫蠟水化，置0.01M檸檬酸緩沖液(pH值6.0)進行熱抗原修復(fù)，自然冷卻至室溫，置3% 過氧化氫阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，山羊血清封閉，滴加一抗(ATF5抗體，工作濃度1∶200)，4℃過夜，次日取出復(fù)溫，孵育二抗(兔kit，工作濃度1∶400)，DAB顯色，自來水充分沖洗，蘇木素復(fù)染細胞核，常規(guī)脫水后封片，拍照。

1.6 免疫細胞化學(xué)法 制作細胞爬片，細胞密度為1×104個/孔，置培養(yǎng)箱過夜，次日取出，4%多聚甲醛固定細胞爬片，滴加0.5% Triton-X 100細胞通透，后續(xù)阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性、封閉、一抗孵育、二抗孵育等步驟同組織免疫組化，ATF5抗體工作濃度1∶200。

1.7 細胞免疫熒光法 取已固定細胞爬片，細胞通透、阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性、封閉步驟同免疫細胞化學(xué)法，滴加一抗(ATF5抗體，工作濃度1∶200)，4℃過夜避光，孵育Fluror 488標(biāo)記山羊抗兔IgG熒光二抗，(工作濃度：1∶100)，DAPI染核，抗熒光衰減封片劑封片，熒光顯微鏡觀察，拍照。

1.8 結(jié)果判定 每張切片隨機選擇5個不同的視野(×200)顯微鏡下觀察，免疫組化：判讀染色強度和陽性細胞百分率，染色強度以多數(shù)細胞呈現(xiàn)的染色強度并減去背景著色計分：無明顯著色為0分，淺褐色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。陽性細胞百分比：0%～5%評為0分，6%～25%評1分，26%～50%評2分，5l%～75%評3分，>75%均評為4分。最終癌組織陽性總得分=陽性癌細胞數(shù)百分率得分+癌細胞陽性強度得分?？偡?分為陰性(-)，<4分為弱陽性(+)，4～6分為中等強度陽性(++)，6～7 分為強陽性(+++)。免疫細胞化學(xué)：用Image-Pro Plus 圖像分析軟件對免疫組化的圖片進行分析，測量光密度(Optical density,OD)值。

2 結(jié)果

2．1 鼻咽癌組織和鼻咽正常組織ATF5蛋白表達的比較 免疫組化檢測顯示：鼻咽正常組織ATF5呈低表達，亞細胞定位主要于細胞漿；初發(fā)鼻咽癌組織ATF5表達水平較正常鼻咽組織表達水平顯著增加，亞細胞主要定位于細胞漿，少量表達于胞核內(nèi)(P<0.05)。與初發(fā)鼻咽癌組織比較，復(fù)發(fā)鼻咽癌組織ATF5表達水平顯著增加(P<0.05)，且亞細胞主要定位于細胞核(見圖1、表1)。

表1ATF5在鼻咽癌和鼻咽正常組織中的表達(n=6)

組織類型ATF5 表達陰性(%)弱陽性(%)中度陽性(%)強陽性(%)鼻咽正常組織 3(50)3(50)0(0)0(0) 初發(fā)鼻咽癌組織?0(0) 1(16.67) 4(66.67) 1(16.67)復(fù)發(fā)鼻咽癌組織? #0(0)0(0)0(0)6(100)

與正常組織比較,*：P<0.05; 與初發(fā)鼻咽癌組織比較,#：P<0.05。

A、B:鼻咽正常組織; C、D:陰性對照組織; E、F:初發(fā)鼻咽癌組織; G、H:復(fù)發(fā)鼻咽癌組織;虛線箭頭：ATF5主要定位于細胞漿;實線箭頭：ATF5主要定位于細胞核(IHC A、C、E、G ×200，B、D、F、H ×400)。圖1 免疫組織化學(xué)法檢測鼻咽癌和正常組織ATF5蛋白的表達

2.2 X線對HONE-1細胞ATF5蛋白表達的影響 免疫細胞化學(xué)法檢測結(jié)果顯示：不同劑量X線(30Gy、40Gy、50Gy)能促進HONE-1細胞ATF5蛋白表達顯著上調(diào)，且高劑量X線(50Gy)照射后ATF5蛋白表達水平上調(diào)更為明顯(P均<0.05，見圖2、表2)；ATF5在HONE-1細胞亞細胞定位也發(fā)生改變，主要表現(xiàn)為細胞核表達顯著增加；細胞免疫熒光法檢測結(jié)果也顯示：HONE-1細胞ATF5蛋白主要定位于細胞核(見圖3)。

表2不同X線劑量對鼻咽癌細胞ATF5IOD值影響

組別ATF5 IODHONE-130.84±6.02HONE-1 10Gy30.51±2.52HONE-1 20Gy38.95±8.27HONE-1 30Gy98.86±4.71?HONE-1 40Gy114.45±11.61?HONE-1 50Gy151.36±14.96?#

與HONE-1比較,*：P<0.05; 與HONE-1 30Gy比較,# ：P<0.05。

*：P<0.05。 圖2 Image-Pro Plus 軟件分析X線對HONE-1細胞ATF5蛋白表達影響

A:細胞免疫組化; B：核DAPI免疫熒光染色為深藍色; C：ATF5免疫熒光染色為綠色; D：雙染色結(jié)果重疊；虛線箭頭：ATF5主要定位于細胞漿；實線箭頭：ATF5主要定位于細胞核,(ICC ×200，IF×200)。圖3 不同劑量X線對HONE-1細胞ATF5蛋白表達影響比較

3 討論

鼻咽癌是常見的頭頸部腫瘤之一，放射治療是其標(biāo)準(zhǔn)治療手段。隨著IMRT技術(shù)廣泛運用及聯(lián)合化療的開展，鼻咽癌根治性治療后5年局部無復(fù)發(fā)生存率(Local recurrence-free survival,LRFS)達83.0%～91.8%，區(qū)域無復(fù)發(fā)生存率(Regional recurrence-free survival,RRFS)達91.0%～96.4%[5]，但仍有10%～36%鼻咽癌患者經(jīng)IMRT或聯(lián)合化療后出現(xiàn)局部和(或)區(qū)域復(fù)發(fā)[6]，放療后局部復(fù)發(fā)多為高劑量區(qū)的野內(nèi)復(fù)發(fā)，其主要與腫瘤的生物學(xué)因素即腫瘤克隆源性細胞放療抵抗有關(guān)[7-8]。放療抵抗也是鼻咽癌復(fù)發(fā)的主要機制之一，與放療抵抗有關(guān)的因素包括細胞周期改變、抗凋亡蛋白增加、DNA損傷修復(fù)及腫瘤乏氧等。ATF5除作為正常細胞存活因子外，還能促進膠質(zhì)瘤、結(jié)腸癌和肺癌等多種腫瘤細胞存活并能增加其侵襲遷移能力，同時誘導(dǎo)肺癌、纖維肉瘤放射抗拒性及胰腺癌對紫杉類藥物耐藥，具有多種致瘤作用[3]，但在肝臟細胞癌ATF5卻有抑癌作用[9]。

目前，已有研究揭示了ATF5在調(diào)節(jié)細胞凋亡逃避、組織侵襲、細胞生物能失調(diào)等多種致癌作用，ATF5表達失調(diào)常見于腦膠質(zhì)瘤、肺癌及胰腺癌等腫瘤[3]。課題組曾研究發(fā)現(xiàn)，ATF5表達水平與鼻咽癌臨床分期呈負(fù)相關(guān)，與TNM分期的T分期顯著負(fù)相關(guān)，與N、M分期無關(guān)[4]。本研究卻發(fā)現(xiàn)，6例初發(fā)鼻咽癌組織ATF5表達水平較正常鼻咽組織表達水平顯著增加，亞細胞主要定位于細胞漿，少量表達于胞核內(nèi)，與腦膠質(zhì)瘤、肺癌及胰腺癌等腫瘤ATF5表達失調(diào)一致[3]。本研究同時發(fā)現(xiàn)，6例局部復(fù)發(fā)鼻咽癌組織ATF5表達水平顯著高于同一患者初發(fā)鼻咽癌局部組織表達水平，且ATF5亞細胞主要定位也發(fā)生改變，主要定位于細胞核，提示鼻咽癌的復(fù)發(fā)可能部分源于ATF5的高表達。另外，Ishihara等[10]研究發(fā)現(xiàn)了ATF5能促進肺癌放療抵抗，且穩(wěn)定轉(zhuǎn)染ATF5的A549細胞對放療也抵抗。為進一步揭示放療與鼻咽癌細胞ATF5表達的關(guān)系，本研究又發(fā)現(xiàn)，隨X-線照射劑量的增加，鼻咽癌HONE-1細胞ATF5蛋白表達水平也顯著增高，亞細胞定位也由胞漿轉(zhuǎn)至細胞核，與復(fù)發(fā)鼻咽癌組織ATF5表達亞細胞定位一致。這進一步提示ATF5表達水平增加可能促進鼻咽癌HONE-1細胞對X-線抵抗，ATF5表達上調(diào)可能與鼻咽癌復(fù)發(fā)有關(guān)。然而，關(guān)于ATF5參與放療抵抗的機制十分復(fù)雜。有研究顯示，ATF5能抑制小鼠肉瘤細胞系QRsP中p53的活性，促進其細胞衰老，使之停滯留于G1期，從而致其對放射抗性增強[11-12]。在膠質(zhì)瘤中，ATF5通過ATF5特異性應(yīng)答元件依賴方式激活BCL2的轉(zhuǎn)錄，其負(fù)性調(diào)節(jié)肽 CP-d / n-ATF5-S1通過去泛素酶Usp9x誘導(dǎo)BAG3，MCL1和BCL2等抗凋亡蛋白下調(diào)[13]。ATF5在乳腺癌中起抗凋亡轉(zhuǎn)錄因子的作用，并且siRNA沉默ATF5能降低了乳腺癌細胞的侵襲力[14]。關(guān)于ATF5表達與鼻咽癌復(fù)發(fā)及參與放療抵抗的機制有待進一步研究。

綜上所述，鼻咽癌的復(fù)發(fā)可能源于ATF5蛋白的高表達，且亞細胞定位主要于細胞核；X線能促進HONE-1細胞ATF5蛋白表達顯著上調(diào)，其亞細胞定位也主要位于細胞核；提示ATF5表達變化可能與鼻咽癌放療抵抗有關(guān)，為預(yù)測鼻咽癌復(fù)發(fā)可提供一定參考價值。