楊 陽，李校天，張九娜，周麗云，郭永澤

0 引 言

食管癌為常見的消化道惡性腫瘤之一，隨著科學(xué)診療技術(shù)的發(fā)展，食管癌的靶向治療成為新的研究熱點(diǎn)，但尚未有大型的專門針對(duì)食管鱗癌靶向治療的相關(guān)研究［1］。研究發(fā)現(xiàn)，血管內(nèi)皮生長因子C（Vascular endothelial growth factor C，VEGFC）的表達(dá)在食管鱗癌組織中明顯高于食管正常黏膜組織［2］；皮層肌動(dòng)蛋白（Cortactin，CTTN）在多種不同來源的腫瘤細(xì)胞中存在過表達(dá)現(xiàn)象且其與食管鱗癌的臨床分級(jí)密切相關(guān)［3-6］。更有研究報(bào)道VEGFC、CTTN兩分子與促進(jìn)食管癌生長及淋巴轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，且兩分子之間可能存在一定的相關(guān)性，但其具體分子機(jī)制及其作用關(guān)系尚未明確［7-9］。據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)資料顯示，我國臨床上確診的食管癌病例中以食管鱗癌較為多見，而大多數(shù)食管鱗癌患者在產(chǎn)生臨床癥狀及就診之前往往早已發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移，故早期發(fā)現(xiàn)并控制疾病發(fā)展是治療的關(guān)鍵［10-11］。因此，本研究通過體外分別干擾人食管鱗癌TE1細(xì)胞中VEGFC、CTTN的基因表達(dá)，探討兩因子對(duì)食管鱗癌細(xì)胞增殖及凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1主要實(shí)驗(yàn)儀器及試劑人食管鱗癌TE1細(xì)胞株（河北醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)），RPMI Medium1640培養(yǎng)基（Solarbio），胰蛋白酶-EDTA消化液（Solarbio），胎牛血清（浙江天杭生物科技股份有限公司），VEGFCsiRNA、CTTNsiRNA、陰性對(duì)照RNA、陽性對(duì)照RNA、siRNA-MATETM轉(zhuǎn)染試劑（蘇州吉瑪基因股份有限公司），CCK-8試劑盒（Solarbio）、流式細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（Solarbio）、TRIzolTM試劑（艾德萊生物），Reverse Transcriptase M-MLV（RNase H-）試劑（TAKARA公司，日本）。

1.2實(shí)驗(yàn)分組實(shí)驗(yàn)根據(jù)添加不同試劑分為：空白組（單純培養(yǎng)細(xì)胞）、MATE轉(zhuǎn)染試劑組（添加MATE試劑）、陰性對(duì)照組（添加陰性對(duì)照RNA及MATE試劑）、陽性對(duì)照組（添加陽性對(duì)照RNA及MATE試劑）、VEGFCsiRNA轉(zhuǎn)染組（添加VEGFCsiRNA及MATE試劑）、CTTNsiRNA轉(zhuǎn)染組（添加CTTNsiRNA及MATE試劑）。各轉(zhuǎn)染基因序列依次為：陰性對(duì)照RNA sencine5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′antisencine5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′；陽 性 對(duì) 照 RNA sencine5′-UGACCUCAACUACAUGGUUTT-3′antisencine5′-AACCAUGUAGUUGAGGUCATT-3′；VEGFCsiRNAsencine5′-CACCUUCUUUAAACCUCCATT-3′antisencine5′-UGGAGGUUUAAAGAAGGUGTT-3′；CTTNsiRNA sencine5′-CCAUGGCUAUGGAGGGAAATT-3′antisencine5′-UUUCCCUCCAUAGCCAUGGTT-3′。

1.3轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染前24h將細(xì)胞接種在96孔板中，以轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞的匯合度在30%～45%為宜。轉(zhuǎn)染前，取125μLDEPC水于1OD的siRNA干粉管中稀釋至20μmol/L。取 0.2μL的上述siRNA溶液加入到50μL無血清1640中，輕輕混勻。加入1μL的siRNA-MATE，加入后立即充分混勻（可用振蕩器振蕩10 s以上），室溫放置10 min（保證足夠時(shí)間靜置，且孵育時(shí)間≤30min），形成siRNA-siRNA-MATE復(fù)合物。在復(fù)合物孵育的10min內(nèi)，從細(xì)胞培養(yǎng)板中移除原有的培養(yǎng)基。每孔加入100μL預(yù)熱的完全培養(yǎng)基（含10%血清和抗生素）。將siRNA-siRNAMATE復(fù)合物50μL滴加到包含細(xì)胞和培養(yǎng)基的孔中并輕晃搖勻。將培養(yǎng)板放置于37℃，CO2培養(yǎng)箱孵育24h。

1.4細(xì)胞總RNA提取取對(duì)數(shù)生長期食管鱗癌細(xì)胞接種于6孔板，按上述分組干預(yù)24h后，棄去培養(yǎng)基，用TRIzol收集細(xì)胞提取總RNA。分光光度計(jì)檢測(cè)RNA的濃度和純度，A260/A280為1.8～2.0時(shí)表明提取的RNA純度較高，可用于熒光定量檢測(cè)。

1.5逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)分別于冰上配置逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液，加入上述提取的RNA溶液共200ng，Olig（dT）18試劑0.5μL，Random primer試劑 0.5μL，并加入 RNase free ddH2O最終配成共12μL的反應(yīng)液，于70℃下作用10min后迅速將其冷卻1min；然后依次加入10mmol/L的dNTP Mixture試劑0.5μL、RNase inhibitor（40U/μL）試 劑 0.25μL、5xM-MLV buffer試 劑4.0μL、RTase M-MLV（RNase H-）試劑 0.5μL，加入ddH2O使其最終達(dá)到20μL，將溶液混勻后于42℃恒溫下作用60min，再于72℃滅活15min，最后于-20℃保存?zhèn)溆谩Ｔ摬襟E及所需試劑均參考Reverse Transcriptase M-MLV（RNase H-）逆轉(zhuǎn)錄試劑說明書進(jìn)行。

1.6 RT-PCR反應(yīng)提前設(shè)計(jì)所需的特異性的正反向引物，具體引物序列依次為：GAPDHrRNA（內(nèi)參）Forward5′-TCCACTGGCGTCTTCACCACCAT-3′Reverse5′-GGAGGCATTGCTGATGATCTTGAGG-3′；VEGFC Forward5′-TTGCCAATCACACTTCCTGCC-3′Reverse5′-TCTTGTTCGCTGCCTGACACT-3′；CTTN Forward5′-CAGGCCGACCGAGTAGACAAGA-3′Reverse5′-CGATACCGTATTTGCCGCCGAA-3′。具體配置反應(yīng)液步驟依次為：正向引物、反向引物各 0.5μL，AceQTMqPCR SYBR? Green Master Mix 10uL，cDNA 2uL（cDNA 稀釋 10倍），ddH2O 7μL。將配好的液體放置于RT-PCR儀上并使用ViiA7TMSystem software軟件設(shè)定反應(yīng)程序，設(shè)定反應(yīng)條件依次為：首先95oC 1min；其次95oC 10s，59oC 20s（此步驟收集熒光信號(hào)），該步驟共進(jìn)行45個(gè)循環(huán)；再于60oC～95oC進(jìn)行溶解曲線分析。采用Applied Biosystems ViiA 7TMReal-Time PCR System檢測(cè)各個(gè)基因的Ct值，所有反應(yīng)均設(shè)3個(gè)復(fù)孔。根據(jù)Comparative Delta-delta Ct法△△Ct=（Ct基因-Ct內(nèi)參基因）-（Ct基因-Ct內(nèi)參基因）對(duì)照組，利用2-△△CT計(jì)算各個(gè)基因相對(duì)于對(duì)照組的表達(dá)量。

1.7 CCK8檢測(cè)細(xì)胞增殖情況細(xì)胞接種于96孔板，待細(xì)胞長至30%～45%時(shí)，按上述步驟進(jìn)行分組干預(yù)，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔。干預(yù)24h后，每孔加入10μL CCK-8，于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育約1h，使用酶標(biāo)儀測(cè)定450nm波長處吸光度值（A值）。細(xì)胞存活率計(jì)算公式如下：

1.8流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況取對(duì)數(shù)生長期食管鱗癌細(xì)胞接種于6孔板，按上述分組干預(yù)24h后，棄去培養(yǎng)基，胰蛋白酶消化細(xì)胞，以1mL1xBinding Buffer懸浮細(xì)胞，4℃ 1200轉(zhuǎn)/min離心5min，棄上清，PBS洗2次，1mL 1xBinding Buffer結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞后，細(xì)胞密度為1×106個(gè)/mL，每管取出100uL液體（細(xì)胞密度1×105個(gè)/mL）分別加入5μL AnnexinV-FITC混勻后室溫避光孵育10min，加入5μL PI室溫避光孵育5min，再于每管加入400μL PBS至500μL液體后，輕柔渦旋混勻，于1h內(nèi)上流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測(cè)。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差（xˉ±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用LSD檢驗(yàn)。以P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 VEGFCmRNA及CTTNmRNA的相對(duì)表達(dá)量的比較VEGFCsiRNA轉(zhuǎn)染組VEGFC mRNA表達(dá)量、CTTNsiRNA轉(zhuǎn)染組CTTN mRNA表達(dá)量較空白組明顯降低（P＜0.05）。證明轉(zhuǎn)染成功。見表1。

表1 各組VEGFC及CTTNmRNA相對(duì)表達(dá)量的比較（）Table 1 Relative expressions of VEGFC and CTTN mRNA in different groups of the ESCC cells（xˉ±s）

表1 各組VEGFC及CTTNmRNA相對(duì)表達(dá)量的比較（）Table 1 Relative expressions of VEGFC and CTTN mRNA in different groups of the ESCC cells（xˉ±s）

與空白組比較，*P＜0.05

組別空白組MATE轉(zhuǎn)染組陰性對(duì)照組陽性對(duì)照組VEGFCsiRNA轉(zhuǎn)染組CTTNsiRNA轉(zhuǎn)染組CTTNmRNA相對(duì)表達(dá)量1.00±0.00 1.05±0.08 0.98±0.08 1.00±0.02 0.97±0.03 0.29±0.02*VEGFCmRNA相對(duì)表達(dá)量1.00±0.00 0.94±0.01 0.93±0.01 0.97±0.04 0.13±0.01*0.96±0.01

2.2各組食管鱗癌細(xì)胞增殖率VEGFCsiRNA轉(zhuǎn)染組及CTTNsiRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞增殖率較其他組均明顯降低（P＜0.05），VEGFCsiRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞增殖率較CTTNsiRNA轉(zhuǎn)染組明顯降低（P＜0.05）。見表2。

2.3流式細(xì)胞儀檢測(cè)食管鱗癌細(xì)胞凋亡率VEGFCsiRNA轉(zhuǎn)染組、CTTNsiRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡率均較其他組明顯增高（P＜0.05），VEGFCsiRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡率較CTTNsiRNA轉(zhuǎn)染組明顯增高（P＜0.05）。見表2。

表2 食管鱗癌細(xì)胞增殖率及凋亡率實(shí)驗(yàn)結(jié)果（xˉ±s，%）Table 2 Proliferation and apoptosis of the ESCC cells in different groups（xˉ±s，%）

3 討 論

食管癌為我國十大惡性腫瘤之一，據(jù)統(tǒng)計(jì)我國以食管鱗狀細(xì)胞癌為主要病理組織類型［12-13］。VEGF又稱血管內(nèi)皮生長因子，其中VEGFC是VEGF家族中最強(qiáng)的促淋巴管生成因子［14-15］，它能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞生物學(xué)行為及細(xì)胞惡變的發(fā)生［16］。CTTN常被稱為皮層肌動(dòng)蛋白，該基因是位于染色體11q13區(qū)上的癌基因［17］，既往研究證實(shí)CTTN是腫瘤細(xì)胞侵襲性偽足的主要功能蛋白［18］。研究顯示VEGFC、CTTN與多種腫瘤致病相關(guān)［19-22］，更有學(xué)者認(rèn)為兩分子與食管鱗癌的癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移及生存活力密切相關(guān)［23］。因此本實(shí)驗(yàn)對(duì)VEGFC、CTTN在食管鱗癌中的表達(dá)及其臨床意義進(jìn)行探討。

為進(jìn)一步證實(shí)VEGFC、CTTN在食管鱗癌中的表達(dá)情況及其相關(guān)作用關(guān)系，本研究前期通過免疫組織化學(xué)等實(shí)驗(yàn)方法，證實(shí)了VEGFC、CTTN在食管鱗癌組織中成高表達(dá)，食管鱗癌的浸潤深度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及淋巴管浸潤與食管鱗癌組織中VEGFC、CTTN的表達(dá)密切相關(guān)等［24］。該結(jié)論為本實(shí)驗(yàn)細(xì)胞學(xué)研究提供了強(qiáng)有力的理論支撐，在此基礎(chǔ)之上，本實(shí)驗(yàn)參照既往shRNA干擾沉默ERCC1對(duì)A549/DDP細(xì)胞增殖與凋亡的成功案例［25］，并通過對(duì)siRNA干擾食管鱗癌細(xì)胞目的基因表達(dá)技術(shù)知識(shí)［26］，開展了siRNA基因干擾技術(shù)，在肯定了既往研究結(jié)果的基礎(chǔ)之上，新技術(shù)的開展也為本課題的研究開創(chuàng)了新的思路與方法。

本實(shí)驗(yàn)主要是對(duì)食管鱗癌細(xì)胞研究，通過RTPCR對(duì)各實(shí)驗(yàn)組VEGFC、CTTN的相對(duì)mRNA表達(dá)量的檢測(cè)，充分證實(shí)了VEGFCsiRNA及CTTNsiRNA轉(zhuǎn)染成功，并肯定了siRNA技術(shù)干擾食管鱗癌細(xì)胞目的基因表達(dá)的可行性。通過對(duì)各組CCK8結(jié)果及流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果的對(duì)比分析證實(shí)了成功干擾食管鱗癌細(xì)胞VEGFC、CTTN表達(dá)后均可抑制食管鱗癌細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡，并通過對(duì)結(jié)果的分析對(duì)比明確了干擾VEGFC的表達(dá)對(duì)食管鱗癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響作用大于CTTN。因此本實(shí)驗(yàn)結(jié)果充分肯定了VEGFC、CTTN與食管鱗癌細(xì)胞生長密切相關(guān)等實(shí)驗(yàn)結(jié)論。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)從細(xì)胞分子學(xué)角度入手，通過成功實(shí)施細(xì)胞學(xué)基因干擾技術(shù)證實(shí)了分別干擾VEGFC、CTTN表達(dá)均可抑制食管鱗癌細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡，且VEGFC較CTTN對(duì)食管鱗癌的生長及凋亡影響作用更為顯著等結(jié)論，為下一步明確兩基因促進(jìn)食管鱗癌淋巴浸潤的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。