孟慶珍 尹 飛 傅超英 陳 凡 劉長軍 袁 娜王 力 張鴻鵠 錢 冬

(1. 寧波大學海洋學院, 寧波 315000; 2. 浙江省杭州市水產技術推廣總站, 杭州 310000;3. 浙江省象山縣海洋與漁業(yè)局, 象山 315711)

中華鱉(Pelodiscus sinensis), 俗稱甲魚等, 屬爬行綱(Reptilia)、龜鱉目(Testudinata)、鱉科(Tironychidae)、鱉屬(Pelodiscus), 我國除西藏、青海、新疆外其他各省均有分布[1]。目前我國中華鱉主要養(yǎng)殖區(qū)域為長江中下游地區(qū)及南方省份。中華鱉營養(yǎng)豐富、風味獨特, 民間認為具有滋補功效, 經(jīng)濟價值較高, 特別是各類龜鱉免疫制品受到廣大消費者喜愛。新型優(yōu)良品種和配套養(yǎng)殖模式極大促進了中華鱉養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展[2]。我國2015年中華鱉總產量3.413×108kg, 主要分布在浙江、廣東、湖北、江蘇、江西、廣西、安徽等地, 浙江省中華鱉養(yǎng)殖產量占全國總產量50%左右, 是全國最大的中華鱉養(yǎng)殖省。隨著人工養(yǎng)殖中華鱉規(guī)模和養(yǎng)殖密度不斷提高, 養(yǎng)殖病害發(fā)生逐漸頻繁[3]。迄今為止已報道30多種中華鱉疾病[4], 先后分離報道了嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)[5]、遲緩愛德華氏菌(Edwardsiella tarda)[6]、奇異變形桿菌(Proteus mirabilis)[7]、摩氏摩根菌(Morganella morganii)[8]等細菌病原。近年來, 還報道了由芽孢桿菌引起的養(yǎng)殖中華鱉疾病[3,9]。

2016年6—7月, 杭州富陽某養(yǎng)殖場中華鱉大量死亡, 體重500g以上成鱉日死亡率20%以上, 嚴重時日死亡100只以上, 造成極大的經(jīng)濟損失。典型癥狀是患病中華鱉游至岸邊, 不斷上下?lián)u頭而亡;解剖后發(fā)現(xiàn)腮腺嚴重充血、肝脾腫大、腸系膜充血。為盡快明確發(fā)病原因, 本研究從瀕死中華鱉中分離到芽孢桿菌, 經(jīng)菌體形態(tài)、生化性狀和16S rDNA和gyrB基因序列分析和系統(tǒng)發(fā)育樹對菌株進行了鑒定, 研究了分離菌株的致病性。

1 材料與方法

1.1 材料

發(fā)病中華鱉來自杭州市某養(yǎng)殖場, 該場單養(yǎng)中華鱉, 養(yǎng)殖總面積0.03 km2, 養(yǎng)殖池平均面積666.67 m2,放養(yǎng)中華鱉約1只/ m2(規(guī)格250 g)。健康中華鱉(200±2) g購自浙江寧波張斌橋市場, 室溫(27±0.5)℃暫養(yǎng)7d無異常后用于感染實驗。4周齡小鼠(18±2) g和乳鼠(3.3±0.1) g由寧波大學實驗動物中心提供。

細菌鑒定采用生物梅里埃API 50 CHB快速生化鑒定條, 購自杭州怡丹生物技術有限公司、實驗用營養(yǎng)瓊脂、LB、10%脫纖維羊血瓊脂平板購自北京陸橋技術股份有限公司, 牛奶瓊脂平板為實驗室自配[10], 芽孢染色液購自杭州濱和微生物試劑有限公司, 瑞氏-姬姆薩染液購自珠海貝索生物技術有限公司、基因組DNA提取試劑盒和p-EASY-T1 Cloning試劑盒購自全式金生物科技有限公司、TaqDNA聚合酶和2×mix購自康為世紀生物科技有公司。

1.2 方法

病樣采集調查養(yǎng)殖場中華鱉發(fā)病時養(yǎng)殖模式和疾病情況, 了解發(fā)病率及死亡率。查看瀕死中華鱉發(fā)病癥狀, 解剖觀察, 取發(fā)病中華鱉血、肝涂片, 用瑞氏-姬姆薩染色, 具體方法見參考文獻[11]。

分離菌株回歸感染取典型癥狀的瀕死中華鱉, 75%酒精體表消毒, 從血、肝、脾、肺、腎分離細菌, 分別接種于營養(yǎng)瓊脂28℃, 培養(yǎng)18h, 挑取純化優(yōu)勢菌株無菌生理鹽水重懸至溶度為4 Mc-Farland。用無菌生理鹽水稀釋至1.2×108、1.2×107、1.2×106CFU/mL, 肌肉注射感染暫養(yǎng)1周的健康中華鱉, 每只注射0.1 mL, 對照注射相同量的無菌生理鹽水, 注射后飼養(yǎng)于140 L水族箱中, 每箱養(yǎng)殖13只, 養(yǎng)殖水深為10—15 cm, 水溫(27±0.5)℃; 試驗期間, 每天用噴壺噴水3—4次, 以保持中華鱉身表濕潤, 每天觀察發(fā)病、死亡情況。

細菌的分離和純化根據(jù)回歸實驗結果, 將感染癥狀與自然發(fā)病癥狀相似的菌株接種于營養(yǎng)瓊脂, 28℃培養(yǎng)18h, 菌株編碼為T91-1, 用含30%甘油的營養(yǎng)肉湯保存于-80℃冰箱備用。

分離菌株T91-1的形態(tài)觀察T91-1菌株在營養(yǎng)瓊脂平板上28℃培養(yǎng)18h, 觀察菌落形態(tài); 并用生理鹽水制取菌懸液做芽孢染色; 取新鮮純培養(yǎng)的直徑約1 mm菌落, 制作切片, 染色, H-7500透射電鏡觀察芽孢的形態(tài), 具體方法見參考文獻[12]。

T91-1菌株生理生化鑒定挑取營養(yǎng)瓊脂平板28℃培養(yǎng)18h的T91-1菌落, 制成溶度為6×108CFU/mL的菌懸液, 接種到API 50 CHB試劑條, 28℃下培養(yǎng) 24h, 觀察顏色變化。同時T91-1接種10%脫纖維羊血瓊脂培養(yǎng)基和脫脂牛奶培養(yǎng)基上, 28℃培養(yǎng)18h, 觀察溶血和蛋白酶活力。

基因擴增、轉化和序列分析T91-1菌株接種至營養(yǎng)瓊脂中培養(yǎng)過夜(28℃), 挑取單菌落在200 μL的去離子水中重懸, 100℃水浴10min, 冰浴5min, 12000 r/min離心5min, 取上清備用。16S rDNA PCR擴增引物為: 27F 5′-AGAGTTTGATCC TGGCTCAG-3′/1492R 5′-GGCTACCTTGTTAC GACTT-3′。50 μLPCR反應體系: 27F、1492R引物(10 μmol/L) 各1 μL, 2×mix 25 μL, 雙蒸水補足體積,PCR擴增條件: 94℃預變性 2min; 94℃ 1min, 53℃1min, 72℃ 1min, 35 個循環(huán); 72℃延伸 7min;PCR擴增產物1%瓊脂糖電泳分離后回收純化PCR產物, 純化16S rDNAPCR產物經(jīng)p-EASY-T1 Cloning試劑盒導入大腸桿菌DH 5α中, 從含氨芐青霉素LB培養(yǎng)基上挑取單一白斑菌落, 提取質粒送華大基因測序。

將所得序列與GenBank中的核酸序列同源性序列比對分析, 選取與菌體T91-1相似性較高的細菌16S rDNA序列, 使用MAGE軟件, 采用鄰接法(Neighbor-joining)獲系統(tǒng)發(fā)育樹, 自展數(shù)據(jù)集為1000次。

GyrB基因擴增和序列分析同上制備DNA模板,GyrB基因PCR擴增引物序列和反應條件見參考文獻[13, 14]。GyrB基因PCR擴增產物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離后用試劑盒回收純化PCR產物, 送華大基因測序。

T91-1對小鼠的毒力將90只健康的小鼠(18±2) g隨機分成十組(每組9只)。同上文方法制備T91-1菌懸液, 以1.5×108、1.5×107、1.5×106和1.5×105CFU/mL小鼠腹腔注射和灌胃, 每只感染0.1 mL, 對照組注射和灌胃等量無菌生理鹽水; 每天觀察發(fā)病、死亡情況。同時, 將36只健康的乳鼠隨機分成4組(每組9只), 以1.2×108、1.2×107、1.2×106CFU/mL濃度分別對每組乳鼠灌胃, 每只注射 0.1 mL, 對照組灌胃等量的無菌生理鹽水, 并觀察發(fā)病、死亡情況。

組織病理觀察自然發(fā)病瀕死中華鱉的組織樣品分別用波恩氏液浸泡1h, 固定的組織用70%乙醇洗至無色, 用70%—100%的乙醇逐級脫水,用石蠟包埋, 切片, HE染色, 在顯微鏡下觀察。

2 結果

2.1 患病癥狀及解剖觀察

患病中華鱉發(fā)病初期四肢無力, 厭食, 反應遲鈍, 游至岸邊, 豎起身體, 不斷上下?lián)u頭而亡(圖版Ⅰ-1); 解剖中華鱉腮腺嚴重充血(圖版 Ⅰ- 3), 脾臟腫大, 呈暗紫色(圖版 Ⅰ-5), 腸系膜出血(圖版 Ⅰ-7)。瑞氏-姬姆薩染色結果如圖, 自然發(fā)病瀕死的中華鱉血(圖版 Ⅰ-9)、肝(圖版 Ⅰ-10)涂片中均發(fā)現(xiàn)大量的短桿狀芽孢桿菌。

2.2 T91-1對中華鱉回歸感染

用分離株T91-1對健康中華鱉進行回歸感染。1.2×108CFU感染的中華鱉在感染后第3天開始出現(xiàn)死亡, 至感染后第7天各實驗組的累計死亡率分別為100%(1.2×108CFU/mL)、100%(1.2×107CFU/mL)、40%(1.2×106CFU/mL)和40%(1.2×105CFU/mL)。用SPSS軟件分析, 其LD50為4.91×105CFU/ind.。發(fā)病和死亡的中華鱉病癥與自然發(fā)病中華鱉癥狀相同, 石蠟切片結果顯示, 攻毒后在瀕死的中華鱉肝、腎組織中, 可見大量短桿狀、革蘭氏陽性的芽孢桿菌。生理鹽水注射對照組無異常癥狀或者死亡, 中華鱉體內未分離到芽孢桿菌。

2.3 T91-1菌株形態(tài)

分離株T91-1在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基表面粗糙、干燥、呈低凸起形, 邊緣不規(guī)則、似圓形、質地松軟、無色素、顏色為灰色的毛玻璃狀菌落, 菌落直徑5—7 mm(圖1A), 菌體大小為(1.0—1.2) μm×(3.0—5.0) μm, 圓形芽孢大小1.0—1.5 μm, 中生或近中生(圖1B)。透射電子顯微鏡下芽孢呈卵圓形,可觀察到前芽孢和已經(jīng)釋放的芽孢(圖1C)。

2.4 T91-1生理生化特性

由表1可見, T91-1為葡萄糖、果糖、甘露醇、淀粉、糖原、核糖、N-乙酰葡萄糖胺、七葉靈、葡萄糖酸鉀陽性; 阿拉伯糖等均為陰性; API系統(tǒng)鑒定生化鑒定系統(tǒng)(APIWEB Plus software V3.2.2 Version)分析表明與蠟樣芽胞桿菌相似度分別為97.4%, 經(jīng)伯杰氏細菌手冊[15]與蠟樣芽胞桿菌ATCC14579基本符合, 鑒定為蠟樣芽胞桿菌。

T91-1在10%脫纖維羊血培養(yǎng)基生長良好,28℃18h菌落為淺灰色、不透明、溶蠟狀, 同時出現(xiàn)明顯的β溶血, 內層為清晰透明的溶血圈, 外層為不完全溶血的半透明溶血圈; 脫脂牛奶平板上, 出現(xiàn)完全透明的蛋白水解圈。

2.5 16S rDNA基因序列和系統(tǒng)發(fā)育分析

將T91-1 16S rDNA基因序列(登錄號: KY648906)進行BLAST同源性序列比對分析, 與蠟樣芽孢桿菌的相似性為99%。在系統(tǒng)發(fā)育樹中, 分離株T91-1與蘇云金芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、維德曼芽孢桿菌(Bacillus wiedmannii)及東洋芽孢桿菌(Bacillus toyonensis)聚為一類, 表明分離株T91-1為蠟樣芽孢桿菌(圖2)。

2.6 gyrB基因序列和系統(tǒng)發(fā)育分析

為進一步確認T91-1的分類地位, 克隆并測定了T91-1gyrB基因序列, BLAST同源性序列比對分析表明: T91-1的gyrB基因蠟樣芽孢桿菌的相似性為99%。系統(tǒng)發(fā)育樹分析T91-1與蠟樣芽孢桿菌聚為一類。綜合16S rDNA進一步鑒定表明為蠟樣芽孢桿菌(圖3)。

2.7 T91-1對小鼠的致病性

為檢測蠟樣芽孢桿菌分離株T91-1對人類的潛在致病性和毒性, 采用ICR乳鼠進行灌胃攻毒。灌胃24h后, 高濃度組(1.2×108CFU/mL)乳鼠全部死亡;48h后, 中濃度組(1.2×107CFU/mL)乳鼠死6只, 低濃度組(1.2×106CFU/mL)乳鼠死3只; 72h后, 各組灌胃乳鼠全部死亡, 死亡鼠出現(xiàn)皮下、腳掌、腦部等出血(圖4)等癥狀; 口灌鹽水組未出現(xiàn)癥狀和死亡。腹腔注射和口灌的4周齡實驗小鼠12—24h出現(xiàn)反應遲鈍、厭食等癥狀, 24h后逐漸恢復正常, 未出現(xiàn)死亡; 對照組未觀察到異常癥狀。

圖1 蠟樣芽孢桿菌分離株T91-1Fig. 1 B. cereus T91-1

表1 API 50 CHB生化鑒定結果Tab. 1 The result of API 50 CHB

圖2 蠟樣芽孢桿菌分離株T91-1的16S rDNA序列鄰接法構建系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 2 Phylogenetic tree constructed from 16S rDNA sequence analysis by Neighbor-Joining method

2.8 發(fā)病中華鱉的主要器官病理特征

取天然發(fā)病中華鱉腎、肝、肺等組織, 固定后經(jīng)HE染色, 可見發(fā)病中華鱉腎、肝、肺出現(xiàn)明顯病理變化, 其中腎損傷嚴重, 近曲小管上皮細胞核腫大, 發(fā)生顆粒變性, 腎小管上皮細胞向管腔靠近,嚴重時相互分離或與基膜剝離, 部分上皮細胞胞核呈溶解狀態(tài), 腎小囊囊腔變大, 腎血管球縮小, 腎小球內皮細胞萎縮, 胞核固縮, 部分腎血管球血管破裂, 紅細胞滲出, 或腎小球壞死、解體, 腎臟結構出現(xiàn)崩解(圖版 Ⅱ); 肝細胞腫大、大量肝細胞顆粒變性, 肝中央靜脈和竇狀隙周圍大量紅細胞, 肝細胞界限模糊, 血管壁上皮細胞增生, 胞質不均勻, 細胞核被擠向一邊, 染色質淡染, 部分消失(圖版 Ⅱ); 肺泡上皮細胞壞死, 血管擴張充血(圖版 Ⅱ-7), 并且出現(xiàn)大量鐵血黃素沉著(圖版Ⅱ-8), 嗜酸性粒細胞浸潤(圖版 Ⅱ-8);心臟血管擴張充血, 組織松散(圖版Ⅱ-10), 心臟組織中可觀察到大量嗜酸性粒細胞浸潤(圖版 Ⅱ-11)。

圖3 蠟樣芽孢桿菌分離株T91-1的gyrB序列鄰接法構建系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 3 Phylogenetic tree constructed from gyrB sequence analysis by Neighbor-Joining method

圖4 T91-1口灌感染乳鼠的皮下出血癥狀Fig. 4 Subcutaneous hemorrhagic symptoms of moribund sucking mice oral infected by B. cereus T91-1

3 討論

2016年6月至7月, 杭州某養(yǎng)殖場中華鱉大面積死亡, 發(fā)病中華鱉血液和肝涂片瑞氏-姬姆薩染色后, 發(fā)現(xiàn)大量芽孢樣桿菌。從瀕死中華鱉中分離到的T91-1回歸感染健康中華鱉可出現(xiàn)與自然發(fā)病中華鱉相似癥狀,LD50為4.91×105CFU/ind., 人工感染發(fā)病中華鱉內臟可分離到大量芽孢桿菌純菌落, 人工感染鱉肝、腎切片中可見大量芽孢桿菌, 表明T91-1對中華鱉有很強致病性, 是本次引起杭州市中華鱉發(fā)病的病原菌。T91-1在營養(yǎng)瓊脂和血平板上呈淺灰色、不透明、毛玻璃狀菌落和典型β溶血;芽孢染色和菌體超薄切片顯示為中生或近中生芽孢。T91-1菌株為葡萄糖、果糖、甘露醇、淀粉、糖原、核糖、N-乙酰葡萄糖胺、七葉靈、葡萄糖酸鉀陽性, 經(jīng)API生化鑒定系統(tǒng)V3.2.2分析表明與蠟樣芽胞桿菌相似度分別為97.4%, 與蠟樣芽胞桿菌典型菌株ATCC14579性狀基本符合[15], 鑒定為蠟樣芽胞桿菌。T91-1的16S rDNA序列和gyrB基因序列分析表明與蠟樣芽孢桿菌的相似性均為99%; 在系統(tǒng)發(fā)育樹上, 16S rDNA序列與同為蠟樣芽孢桿菌群的蠟樣芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌(B. thuringiensis)以及近年來新發(fā)現(xiàn)的維德曼芽孢桿菌(B.wiedmannii)及東洋芽孢桿菌(B. toyonensis, 又譯作圖瓦永芽孢桿菌)聚為一類;gyrB基因系統(tǒng)發(fā)育樹分析表明T91-1與同為蠟樣芽孢桿菌群的蠟樣芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌和炭疽芽孢桿菌(B. anthracis)聚為一類。綜合上述分析, 確定T91-1為蠟樣芽孢桿菌。T91-1血平板上呈典型β溶血, 與蘇云金芽孢桿菌、蕈狀芽孢桿菌的弱溶血及炭疽芽孢桿菌的不溶血有明顯區(qū)別[16]。

蠟樣芽孢桿菌在自然界分布廣泛, 不同菌株的致病性差異性大[17]。蠟樣芽孢桿菌也是重要的食源性致病菌, 可造成人類患嘔吐綜合癥、腹瀉綜合癥等疾病, 患者可發(fā)生心內膜炎和敗血癥等癥狀[18,19],也可引起新生兒患腦膜炎直至致死[20]。近年來, 蠟樣芽孢桿菌引起水生生物致病的報道有增加的趨勢, 先后報道了刺參(Stichopus japonicus)[21]、中華鱉[9]、南美白對蝦(Penaeus vannamei)[22]、錦鯉(Cryprinus carpio)[23]、羅非魚(Oreochromis niloticus)[24]等水生動物的芽孢桿菌感染[24]。譚愛萍等[9]最早報道了由蠟樣芽孢桿菌引起的養(yǎng)殖中華鱉疾病, 發(fā)病鱉四肢無力、反應遲鈍、身體豎起、搖頭而死, 主要發(fā)生于5—7月, 可危害幼鱉、成鱉和親鱉等, 主要危害100 g以上體重鱉, 發(fā)病率可達15%—30%, 嚴重時最高死亡率可達100%。廣東分離的蠟樣芽孢桿菌JY07和JY09對中華鱉半數(shù)致死量為3.39×108CFU/mL。2014年, 陳健舜報道了杭州市由蘇云金芽孢桿菌(B.thuringiensis)引起的中華鱉疾病, 分離菌株注射感染健康中華鱉的LD50為1×104.87—105.30CFU/ind.即1×105.87—106.30CFU/mL, 本研究分離的蠟樣芽孢桿菌T91-1對健康甲魚的LD50為4.91×105CFU/ind., 相當于4.91×106CFU/mL, 毒力強度與Chen等[3]報道相似, 而分類鑒定與譚愛萍相同。鑒于蠟樣芽孢桿菌群各個種, 系統(tǒng)進化樹上十分接近, 為明確分離菌株的分類地位, 本研究對生化性狀、16S rDNA和gyrB等進行了綜合比較, 最后確定為蠟樣芽孢桿菌。同時對發(fā)病中華鱉進行了系統(tǒng)的病理分析, 對分離菌株的毒力因子及溶血素BL (hbl)基因進行了分析(待發(fā)表資料), 確定了分離菌株的致病性和在本病例中的作用。

圖版Ⅰ 自然發(fā)病瀕死中華鱉癥狀PlateⅠ Gross signs of naturally infected Chinese soft-shelled turtles

圖版Ⅱ 中華鱉組織病理特征PlateⅡ Histopathological characteristics in Chinese soft-shelled turtle

本研究分離的蠟樣芽孢桿菌T91-1呈典型的β溶血, 同時含有較高水平的胞外蛋白酶, 但培養(yǎng)上清單獨不具有溶血能力。文獻報道表明蠟樣芽孢桿菌的溶血現(xiàn)象與溶血素BL有關, 該溶血素由L2、L1和B幾個不同的溶血組份組成, 通過各組成與紅細胞膜單獨或協(xié)同結合, 造成紅細胞破碎[25],該毒素是導致人類食物中毒的重要毒力因子[26]。從T91-1對乳鼠灌胃毒力強于注射感染來看, T91-1對小鼠具有較大的腸毒性, 對人類可能構成潛在的風險。T91-1回歸感染健康中華鱉后可使實驗鱉排泄物增多, 提示分離菌株對鱉存在較大的腸毒性。需要對分離株非溶血性腸毒素nhe(NHE)[27]和溶血性毒素hbl(HBL)[28—31]開展進一步研究。

值得注意的是, 本次從杭州市中華鱉養(yǎng)殖場分離到的蠟樣芽孢桿菌, 該病原可在該場所有發(fā)病池分離到, 發(fā)病鱉癥狀相似, 病鱉各臟器、血液及腦部均可分離到單一的芽孢桿菌樣純培養(yǎng), 同期杭州市其他發(fā)病的中華鱉養(yǎng)殖場未分離到優(yōu)勢的芽孢桿菌, 表明該病未在杭州市其他中華鱉養(yǎng)殖場引起流行。分析發(fā)病場中華鱉養(yǎng)殖條件, 發(fā)現(xiàn)該場養(yǎng)殖密度較高, 水質藍藻水平極高, 2016年和2017年均發(fā)生芽孢桿菌大規(guī)模感染。該病原是來源于帶毒力基因蠟樣芽孢桿菌制劑的不當使用, 還是在養(yǎng)殖環(huán)境周邊存在較高的蠟樣芽孢桿菌背景, 需要進一步跟蹤分析。