廖鵬程,劉 萍,曾 琴,鄒湘渝,聶敏?！?/p>

(1.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬三二〇一醫(yī)院口腔科門診,陜西漢中723000;2.西南醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院/口頜面修復(fù)重建和再生實(shí)驗(yàn)室,四川瀘州 646000)

口腔鱗狀細(xì)胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)簡(jiǎn)稱口腔鱗癌，是頭頸部最易好發(fā)的以影響口腔黏膜襯里上皮為主的惡性腫瘤[1]。在世界上常見的腫瘤致死排行榜中位居第6[2]。在發(fā)展中國(guó)家，它是第3常見的惡性腫瘤[1]。隨著對(duì)口腔鱗癌研究的不斷深入，以及在臨床上治療方法的不斷改進(jìn)，患者的術(shù)后生存率有了一定的改善，但仍在50%左右[3]。黏著斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)是一種位于細(xì)胞內(nèi)的非受體型酪氨酸激酶[4]。它與細(xì)胞的黏附密切相關(guān)，同時(shí)介導(dǎo)多條信號(hào)通路，與腫瘤的預(yù)后有著重要關(guān)系。 TAE226是一種雙苯胺嘧啶類化合物，已被開發(fā)成為一種小分子酪氨酸激酶抑制劑，具有三磷酸腺苷(ATP)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合性，它的作用靶點(diǎn)為FAK[5]。本實(shí)驗(yàn)采用CCK-8法檢測(cè)不同濃度的TAE226干預(yù)HSC-3細(xì)胞后，對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的影響。

1 材料與方法

1.1材料來源 人口腔鱗癌HSC-3細(xì)胞株由四川大學(xué)華西口腔醫(yī)學(xué)院、口腔疾病研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。DMEM培養(yǎng)液(Hyclone,賽默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司)，優(yōu)質(zhì)胎牛血清(北京索萊寶生物科技有限公司)，TAE226(Selleck，上海藍(lán)木化工有限公司)，DMSO(美國(guó)AMRESCO公司)，CCK-8試劑盒(DojinDo，日本同仁化學(xué)研究所)，細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒(南京凱基生物)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) HSC-3細(xì)胞株培養(yǎng)于含10%胎牛血清,100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)液中，置于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定期換液。

1.2.2TAE226配置 TAE226溶解于DMSO中，調(diào)整濃度為1 mmol/L,再用培養(yǎng)液配置成1、5、10、20 μmol/L的不同濃度貯存液，將其置于4 ℃冰箱備用，母液放于-80 ℃冰箱中長(zhǎng)期保存。

1.2.3CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為5×104個(gè)/mL，將細(xì)胞懸液接種于96孔板上。設(shè)置對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組。實(shí)驗(yàn)組每孔加入100 μL細(xì)胞懸液，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24 h，吸去原培養(yǎng)液，對(duì)照組每孔加入新鮮培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)組加入不同濃度的TAE226共100 μL，繼續(xù)培養(yǎng)12、24、36、48、60、72 h。待藥物共培養(yǎng)結(jié)束后，棄去孔中液體。實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組及空白組加入含有10% CCK-8液的新鮮培養(yǎng)液100 μL。于波長(zhǎng)450 nm的酶標(biāo)儀上測(cè)光密度(OD)值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期分布 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為3×105個(gè)/mL，將細(xì)胞懸液接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h。棄原培養(yǎng)液，對(duì)照組每孔加入新鮮培養(yǎng)液2 mL，實(shí)驗(yàn)組每孔加入不同濃度的TAE226 2 mL，將6孔板放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。取出6孔板，吸除廢液，漂洗2～3次，0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞3～4 min，低速離心收集細(xì)胞，加入預(yù)冷70%乙醇，4 ℃固定過夜。低速離心，吸除上清液。每孔加入染色緩沖液500 μL，重懸細(xì)胞。加入碘化丙啶染色液各孔 25 μL，RNase A 各孔 10 μL，混勻，分散細(xì)胞。避光 37 ℃ 溫浴30 min。流式細(xì)胞儀在激發(fā)波長(zhǎng)488 nm 處檢測(cè)細(xì)胞周期分布。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況 細(xì)胞種板和細(xì)胞收集同前細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)。收集細(xì)胞后，PBS液漂洗2～3次，鏡下調(diào)整細(xì)胞密度為(1～5)×105個(gè)/mL。加入500 μL的Binding Buffer，混勻。加入5 μL的Annexin-FITC混勻后，加入5 μL Propidium Iodide，混勻。室溫，避光反應(yīng)5～15 min。于1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)射波長(zhǎng)530 nm、激發(fā)波長(zhǎng)488 nm下的細(xì)胞凋亡率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié) 果

2.1TAE226對(duì)口腔鱗癌HSC-3細(xì)胞增殖的抑制作用 當(dāng)TAE226的濃度為1 μmol/L，在12 h時(shí)與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但是隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。隨著TAE226的濃度增至5、10、20 μmol/L時(shí)，在同一濃度下，隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，其對(duì)HSC-3細(xì)胞增殖的抑制作用逐漸增強(qiáng)；同一時(shí)間下，隨著TAE226濃度的增加，TAE226對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用逐漸增強(qiáng)(P<0.05)，見表1和圖1。

表1 不同濃度的TAE226于不同時(shí)間下HSC-3細(xì)胞的OD值

圖1 不同濃度的TAE226于不同時(shí)間下HSC-3細(xì)胞的OD值

2.2TAE226對(duì)口腔鱗癌HSC-3細(xì)胞凋亡的影響 在TAE226作用于HSC-3細(xì)胞24 h后，TAE226濃度為1、5、10、20 μmol/L的實(shí)驗(yàn)組凋亡率分別為1.59%、8.50%、28.47%、49.05%。與對(duì)照組的0.08%相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，隨著TAE226濃度的不斷增高，其對(duì)HSC-3的促凋亡作用越明顯，見圖2。

2.3TAE226對(duì)口腔鱗癌HSC-3細(xì)胞周期的影響 在細(xì)胞周期各階段，對(duì)照組與1 μmol/L TAE226實(shí)驗(yàn)組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。而對(duì)照組與其余各實(shí)驗(yàn)組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。在G1期和S期比較時(shí)發(fā)現(xiàn)10 μmol/L和20 μmol/L實(shí)驗(yàn)組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。當(dāng)TAE226的濃度達(dá)到5 μmol/L時(shí)，細(xì)胞周期G1期和S期所占比例逐漸降低，而G2期所占比例逐漸升高。組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表2、圖3。

A:對(duì)照組；B：TAE226濃度為1 μmol/L實(shí)驗(yàn)組；C：TAE226濃度為5 μmol/L實(shí)驗(yàn)組；D：TAE226濃度為10 μmol/L實(shí)驗(yàn)組；E：TAE226濃度20 μmol/L實(shí)驗(yàn)組

圖2 不同濃度的TAE226對(duì)HSC-3細(xì)胞凋亡的影響

A:對(duì)照組；B：TAE226濃度為1 μmol/L實(shí)驗(yàn)組；C：TAE226濃度為5 μmol/L實(shí)驗(yàn)組；D：TAE226濃度為10 μmol/L實(shí)驗(yàn)組；E：20 μmol/L實(shí)驗(yàn)組

圖3 TAE226對(duì)HSC-3細(xì)胞周期的影響

3 討 論

口腔鱗癌是頭頸部最易好發(fā)的惡性腫瘤，全世界每年有65萬以上的人被診斷為口腔鱗癌，同時(shí)每年約有35萬的人死于口腔鱗癌[6]，近年來隨著人們生活環(huán)境和生活方式的改變，口腔鱗癌的發(fā)生趨于年輕化。在過去的十年里，口腔鱗癌的發(fā)病率有所下降，但近20年來患者的5年生存率僅有約5%的提升，生存率的上升基本處于停滯狀態(tài)[7]。越來越多的學(xué)者將目光集中于高效藥物和早期診斷的靈敏指標(biāo)的尋找。

FAK在不同來源的腫瘤細(xì)胞中隨著腫瘤的分化程度及轉(zhuǎn)移狀態(tài)的不同，它的核酸和蛋白的表達(dá)量也不盡相同，但目前多認(rèn)為在惡性程度高的腫瘤或者已經(jīng)發(fā)生了轉(zhuǎn)移的腫瘤組織中，F(xiàn)AK的表達(dá)有顯著的提高。在惡性腫瘤的早期事件中可以發(fā)現(xiàn)FAK的過表達(dá)，并且這種現(xiàn)象會(huì)持續(xù)存在[8]。WANG等[2]通過對(duì)108例口腔鱗狀細(xì)胞癌患者的病變組織和正常組織的比較研究中發(fā)現(xiàn)，miR-433可通過ERK/MAPK信號(hào)通路來下調(diào)FAK，從而抑制SCC-9細(xì)胞增殖、遷移、侵襲。CHANG等[9]通過提高生長(zhǎng)緩慢時(shí)期的SCC-25細(xì)胞的FAK表達(dá)量，可以促進(jìn)導(dǎo)致雌激素受體α(estrogen receptor alpha，ERA)的磷酸化、轉(zhuǎn)錄活性和細(xì)胞生長(zhǎng)速率的增加。實(shí)驗(yàn)中通過降低生長(zhǎng)快速時(shí)期的SCC-25中FAK表達(dá)量，可以降低ERA的磷酸化和細(xì)胞的活性，抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)。由此說明口腔鱗癌的活性可被FAK/AKT信號(hào)增強(qiáng)，這也是其促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)的關(guān)鍵[9]。CHIU等[10]研究發(fā)現(xiàn)相比于侵襲性低的SCC-4細(xì)胞，侵襲性強(qiáng)的OECM-1細(xì)胞的FAK和pY397高表達(dá)，同時(shí)與GDP相關(guān)聯(lián)的Rac-1也高表達(dá)。當(dāng)沉默OECM-1細(xì)胞中的FAK，Rac-1表達(dá)量明顯降低，而這一變化也使得細(xì)胞的侵襲性降低，由此說明了抑制FAK在Py397位點(diǎn)的磷酸化或降低Rac-1的活性，可作為治療轉(zhuǎn)移性口腔鱗狀細(xì)胞癌的一種治療策略。本項(xiàng)研究旨在探索FAK的抑制劑TAE226對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞的相關(guān)作用，以期尋找出合適的高效治療藥物。

TAE226可通過阻斷FAK與ATP的連接位點(diǎn)及FAK的Y397位點(diǎn)和Y861位點(diǎn)的自磷酸化，從而抑制FAK的活性[11]。BEIERLE等[12]研究得出用TAE226處理了人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞后，F(xiàn)AK磷酸化水平呈濃度依賴性下降，細(xì)胞活力下降，細(xì)胞周期阻滯，細(xì)胞的凋亡增加。

本實(shí)驗(yàn)中的研究發(fā)現(xiàn)TAE226可以有效地抑制細(xì)胞增殖，在濃度為1 μmol/L時(shí)效果并不明顯，但是隨著濃度的不斷增加，抑制效果越來越強(qiáng)。這與文獻(xiàn)[2,9]結(jié)果相一致。同時(shí)TAE226可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡事件的發(fā)生，而這與其影響了細(xì)胞周期的關(guān)系密不可分，在細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，TAE226將HSC-3細(xì)胞阻滯于G2期，這與BEIERLE等[12]的研究相吻合。處于G2期的細(xì)胞已經(jīng)完成了DNA的復(fù)制，處于相關(guān)蛋白的形成階段及細(xì)胞的有絲分裂階段，由此可以看出TAE226的作用位點(diǎn)主要與蛋白及RNA相關(guān)，同時(shí)也再次驗(yàn)證了上述增殖實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，這也為后續(xù)的研究提供了一定的依據(jù)。

本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了TAE226可以抑制口腔鱗癌細(xì)胞HSC-3細(xì)胞株的增殖，促進(jìn)細(xì)胞的凋亡，同時(shí)將細(xì)胞阻滯于G2期，導(dǎo)致細(xì)胞的活力下降。以上結(jié)論可為口腔鱗癌的機(jī)制研究提供一定的理論依據(jù)。但是其對(duì)蛋白分子水平和RNA等基因水平的具體影響和機(jī)理還未可知，需要進(jìn)一步的研究。