王嫻婷 鄭良達(dá) 解晶

[摘要] 目的 研究多發(fā)性骨髓瘤（MM）患者骨髓組織中微小RNA-181a（miRNA-181a）與miRNA-373的表達(dá)，探討其臨床意義。 方法 選取2015年3月～2017年3月浙江省臺州市第一人民醫(yī)院收治的67例MM患者作為病例組，選取同期患其他血液疾病的40例患者作為病例對照組、40例健康體檢人員作為健康對照組。采用實(shí)時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）檢測各組骨髓組織中miRNA-181a及miRNA-373的表達(dá)，分析各組間兩者的表達(dá)差異及其與MM臨床病理特征的關(guān)系。Pearson線性相關(guān)分析分析miRNA-181a與miRNA-373表達(dá)的相關(guān)性。 結(jié)果 分別與病例對照組及健康對照組比較，病例組miRNA-181a表達(dá)明顯較高，miRNA-373表達(dá)明顯較低（P < 0.05），而病例對照組與健康對照組miRNA-181a、miRNA-373表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。病例組患者骨髓組織中miRNA-181a、miRNA-373表達(dá)與腫瘤分期、腫瘤分化有關(guān)（均P < 0.05），其與年齡、性別、細(xì)胞學(xué)分型及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)（均P > 0.05）。病例組骨髓組織中miRNA-181a與miRNA-373表達(dá)呈明顯負(fù)相關(guān)（r = -0.696，P < 0.05）。病例對照組和健康對照組的miRNA-181a與miRNA-373表達(dá)無相關(guān)性（r = 0.151、0.179，均P > 0.05）。 結(jié)論 MM骨髓組織中miRNA-181a表達(dá)升高，而miRNA-373表達(dá)降低，兩者共同參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程，可能成為新的MM診斷、治療及預(yù)后評估的標(biāo)志物。

[關(guān)鍵詞] 多發(fā)骨髓瘤；微小RNA-181a；微小RNA-373；相關(guān)性

[中圖分類號] R733.3 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2019）04（b）-0085-05

Expression and correlation analysis of miRNA-181a and miRNA-373 in bone marrow tissue of patients with multiple myeloma

WANG Xianting1 ZHENG Liangda1 XIE Jing2 JIANG Wenhua1

1.Department of Hematology and Oncology， Taizhou First People′s Hospital， Zhejiang Province， Taizhou 318020， China； 2.Department of Laboratory， Taizhou First People′s Hospital， Zhejiang Province， Taizhou 318020， China

[Abstract] Objective To investigate the expression of microRNA-181a （miRNA-181a） and miRNA-373 in bone marrow of patients with multiple myeloma （MM） and to explore its clinical significance. Methods A total of 67 patients with MM who were treated in Taizhou First People′s Hospital from March 2015 to March 2017 were selected as the case group， 40 patients with other blood diseases in the same period were selected as the case control group and 40 healthy people were selected as the healthy control group. Quantitative real-time PCR （qRT-PCR） was used to detect the expression of miRNA-181a and miRNA-373 in bone marrow tissues of each group. The differences in the expression of miRNA-181a and miRNA-373 between these groups and their correlation with clinicopathological features of MM were analysed. Pearson linear correlation analysis were used to show the correlation between miRNA-181a and miRNA-373 expression. Results Compared with the case control group and the healthy control group， the expression of miRNA-181a was significantly higher in the case group and the expression of miRNA-373 was significantly lower （P < 0.05）， but there was no difference in the expression of miRNA-181a and miRNA-373 between the case control group and the healthy control group （P > 0.05）. The expression of miRNA-181a and miRNA-373 in bone marrow tissue of MM patients was related to tumor stage and tumor differentiation （P < 0.05）， but not related to age， gender， cytological type and lymph node metastasis （P > 0.05）. There was a significant negative correlation between miRNA-181a and miRNA-373 expression in the bone marrow of the case group （r = -0.696， P < 0.05）. There was no significant correlation between the case control group and the healthy control group （r = 0.151， 0.179， P > 0.05）. Conclusion The expression of miRNA-181a is increased in MM bone marrow tissue， and the expression of miRNA-373 is decreased. Both of them participate in the tumor development and progression， which may become a new marker for diagnosis， treatment and prognosis of MM.

[Key words] Multiple myeloma； MicroRNA-181a； MicroRNA-373； Correlation

多發(fā)性骨髓瘤（MM）是骨髓微環(huán)境中漿細(xì)胞的異?？寺≡鲋澈脱懈咚降膯慰寺∶庖咔虻鞍祝稍斐晒切該p害、貧血及腎臟損害，近年來MM發(fā)病率有逐漸增高的趨勢[1-2]。尋找可靠的MM腫瘤標(biāo)志物，對于早期診斷、治療方案選擇及病情監(jiān)測等具有重要意義[3]。微小RNA（miRNA）由18～25個核苷酸組成，研究[4]表明，MM患者骨髓組織中存在多種miRNA表達(dá)失調(diào)的現(xiàn)象，其參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞的浸潤和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。miRNA-181a是miR-181家族構(gòu)成成員，該家族還包括miRNA-181b、miRNA-181c和miRNA-181d，其可通過靶向多種靶基因來調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程[5]。miRNA-373位于19q13.42，在多種腫瘤，如卵巢癌、多形膠質(zhì)母細(xì)胞瘤等中均發(fā)現(xiàn)miRNA-373具有抑癌基因的功能，其可靶向rab22a等基因，抑制腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移[6]。然而，目前關(guān)于miRNA-181a和miRNA-373在MM中的表達(dá)及與臨床病理特征的關(guān)系研究較少。本研究通過檢測MM患者骨髓組織中miRNA-181a和miRNA-373表達(dá)水平，分析兩者表達(dá)的相關(guān)性，探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年3月～2017年3月浙江省臺州市第一人民醫(yī)院（以下簡稱“我院”）收治的67例MM患者作為病例組，選取同期診治的40例其他血液疾病患者作為病例對照組、40例骨髓穿刺證實(shí)骨髓功能正常的健康人群作為健康對照組。MM納入標(biāo)準(zhǔn)：①所有MM患者骨髓組織經(jīng)病理診斷確診，MM的診斷符合國際骨髓瘤工作組（IMWG）2014年對MM診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]；②臨床病理資料完整，患者及其家屬均知情同意并簽字；③患者均為首次診治，之前未接受過其他治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他器官系統(tǒng)的惡性腫瘤；②妊娠期或哺乳期婦女；③合并急性感染性疾病；④合并其他血液系統(tǒng)疾病。病例組男35例，女32例；年齡39～71歲，平均（57.4±7.2）歲；按照國際分期系統(tǒng)（ISS）進(jìn)行分期，其中Ⅰ期29例，Ⅱ期25例，Ⅲ期13例。病例對照組男22例，女18例；年齡40～70歲，平均（59.2±6.3）歲；其中非霍奇金淋巴瘤13例，急性淋巴細(xì)胞白血病9例，慢性粒細(xì)胞白血病11例，慢性淋巴細(xì)胞白血病7例，該組患者診斷符合2007年《血液病診斷和療效標(biāo)準(zhǔn)》[8]。健康對照組男21例，女19例；年齡38～68歲，平均（57.0±6.8）歲。三組研究對象性別、年齡比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05），具有可比性。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)同意。

1.2 檢測方法

實(shí)時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）檢測各組miRNA-181a和miRNA-373的表達(dá)。采用Trizol法提取骨髓組織中總RNA，實(shí)驗(yàn)步驟按照Trizol試劑盒說明書進(jìn)行（購自美國Invitrogen公司，生產(chǎn)批號：127906）。以5 μL總RNA為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，應(yīng)用TaqMan miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（購自美國ABI公司，生產(chǎn)批號：1203125）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反應(yīng)條件：16℃ 30 min，42℃ 30 min，85℃ 5 min。得到cDNA后進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照miRNA-181a和miRNA-373PCR試劑盒說明書進(jìn)行（購自美國ABI公司，生產(chǎn)批號：20142322、20132618）。反應(yīng)條件為：95℃ 1 min，95℃ 15 s，60℃ 1 min，72℃ 10 s延伸，40個循環(huán)。miRNA-181a反轉(zhuǎn)錄引物序列：5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACT-GGATACGACAACTCAC-3′，正向引物序列：5′-GCG-GCGAACATTCAACGATG-3′，反向引物序列：5′-GTG-CAGGGTCCGAGG-3′。miRNA-373反轉(zhuǎn)錄引物序列：5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCA-CTGGATACGACACACCC-3′，正向引物序：5′-GGG-GAAGTGCTTCGATTTTG-3′，反向引物序列：5′-CAG-TGCAGGGTCCGAGGTAT-3′。內(nèi)參基因U6反轉(zhuǎn)錄引物序列：5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAAT-TCAGTTGAGATATGGAA-3′，上游序列：5′-ACACT-CCAGCTGGGATTCGTGAAGCG-3′，下游序列：3′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGG-5′。反轉(zhuǎn)錄引物、PCR引物和探針均購自ABI生物公司。所有反應(yīng)均在ABI實(shí)時定量PCR儀上完成，每個樣本重復(fù)3次。采用相對Ct值進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，目的基因miR-181a/miRNA-373 mRNA的表達(dá)水平相對于內(nèi)參基因U6的比值為2-ΔΔCt，計算miR-181a/miRNA-373的相對定量表達(dá)水平，其中ΔCt = CtmiR-181a/miRNA-373-CtU6。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），SNK-q法檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用Pearson線性相關(guān)分析。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組骨髓組織中miRNA-181a、miRNA-373表達(dá)比較

病例組、病例對照組及健康對照組骨髓組織中miRNA-181a的相對表達(dá)水平分別為（123.17±19.10）、（73.32±12.65）、（64.11±10.05）。病例組miRNA-181a表達(dá)顯著高于病例對照組及健康對照組（t = 3.458、3.679，P = 0.000、0.000），而病例對照組與健康對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t = 0.247，P = 0.805）。病例組、病例對照組及健康對照組骨髓組織中miRNA-373的相對表達(dá)水平分別為（0.41±0.10）、（0.82±0.07）、（1.01±0.12），病例組miRNA-373表達(dá)顯著低于病例對照組及健康對照組（t = 2.114、2.613，P = 0.038、0.011），而病例對照組與健康對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t = 0.529，P = 0.598）。見圖1。

2.2 病例組miRNA-181a、miRNA-373表達(dá)與MM臨床病理特征的相關(guān)性

病例組患者骨髓組織中miRNA-181a、miRNA-373表達(dá)與腫瘤分期、腫瘤分化有關(guān)（均P < 0.05），而其與年齡、性別、細(xì)胞學(xué)分型及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)（均P > 0.05）。見表1。

2.3 各組miRNA-181a、miRNA-373表達(dá)的相關(guān)性

病例組骨髓組織中miRNA-181a與miRNA-373表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)（r = -0.696，P = 0.000）。見圖2。病例對照組和健康對照組miRNA-181a與miRNA-373表達(dá)無明顯相關(guān)性（r = 0.051、0.179，P = 0.206、0.097）。

3 討論

隨著對MM發(fā)病機(jī)制研究的不斷深入，尋找早期診斷、治療和判斷預(yù)后的腫瘤標(biāo)志物是學(xué)者們研究的重點(diǎn)。非編碼RNA包括miRNA、lncRNA等，可以在RNA 水平行使各自的生物學(xué)功能。多種miRNA通過調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)參與MM的發(fā)生、發(fā)展病理生理過程。有學(xué)者[10]在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，骨髓瘤細(xì)胞miR-181a表達(dá)上調(diào)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移。本研究病例組miRNA-181a表達(dá)顯著高于病例對照組及健康對照組，而病例對照組及健康對照組的表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05），與以往研究[11]結(jié)果一致。其機(jī)制可能與腫瘤微環(huán)境中白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）生成增加導(dǎo)致miRNA-181a表達(dá)上調(diào)有關(guān)，miRNA-181a結(jié)合下游抑癌基因PTEN mRNA的3′UTR區(qū)，抑制翻譯過程，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，當(dāng)shRNA下調(diào)miRNA-181a表達(dá)后，其促進(jìn)增殖的作用得到逆轉(zhuǎn)[12-13]。病例組患者骨髓組織中miRNA-181a表達(dá)與腫瘤分期、腫瘤分化有關(guān)，腫瘤分期越高，腫瘤分化越差，骨髓組織中miRNA-181a表達(dá)越高，與以往報道[14]一致。其機(jī)制可能是miRNA-181a高表達(dá)能顯著上調(diào)細(xì)胞周期的關(guān)鍵啟動因子Cyclin D，促進(jìn)G1期向S期的轉(zhuǎn)換，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞異常增殖[15]。此外，miRNA-181a高表達(dá)激活PI3K-Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，促進(jìn)下游基因表達(dá)，如微管蛋白的合成，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移[16]。

研究[17]表明，位于染色體19q13.42的miRNA-373在腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用。本研究病例組患者的miRNA-373表達(dá)水平顯著低于病例對照組及健康對照組，而病例對照組與健康對照組miRNA-373表述無顯著差異，其機(jī)制可能是miRNA-373基因位點(diǎn)的雜合性缺失或基因表觀遺傳學(xué)修飾，如甲基化、泛素化等等引起的基因功能失活[18]。此外，RNA Pol Ⅲ負(fù)責(zé)miRNA的產(chǎn)生并有助于調(diào)節(jié)細(xì)胞的生物合成能力，某些作為聚合酶成分的因子如BRF2異常時，引起RNA Pol Ⅲ轉(zhuǎn)錄的失調(diào)，也可導(dǎo)致關(guān)鍵RNA的生成異常，導(dǎo)致細(xì)胞生長失控[19]。此外，腫瘤分期越高，腫瘤分化越差，骨髓組織中miRNA-373表達(dá)越低。其原因可能是miRNA-373在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起抑制基因的作用，miRNA-373能抑制RAS通路中的幾個關(guān)鍵基因的表達(dá)，如RAB22A、RASSF1A等，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，當(dāng)shRNA沉默miRNA-373表達(dá)后，其抑制增殖的作用消失[20]。miRNA-373能直接靶向LATS2，抑制腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力[21-22]。此外，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）對腫瘤的遷移和侵襲至關(guān)重要，miRNA-373表達(dá)顯著下調(diào)時，影響下游靶基因IRAK2與LAMP1的表達(dá)，導(dǎo)致EMT的上皮標(biāo)志物E-鈣黏蛋白的表達(dá)降低，間充質(zhì)標(biāo)志物N-鈣黏蛋白的表達(dá)增加[23]。此外，本研究中miRNA-181a與miRNA-373間表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)，而兩者在病例對照組和健康對照組中的表達(dá)無明顯相關(guān)性。因此，miRNA-181a與miRNA-373可能通過腫瘤癌基因、抑癌基因及腫瘤細(xì)胞增殖的調(diào)控過程參與多發(fā)性骨髓瘤的發(fā)生、發(fā)展過程。

綜上所述，多發(fā)性骨髓瘤患者骨髓組織中miRNA-181a表達(dá)增加，而miRNA-373表達(dá)減少，兩者共同參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程，可能成為多發(fā)性骨髓瘤診斷、治療及預(yù)后評估的新的腫瘤標(biāo)志物。但本研究樣本量少，兩者的具體作用機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

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（收稿日期：2019-01-15 本文編輯：王 蕾）