郝霞莉 李根池 曹 威

脫毛膏是較常見(jiàn)的一種脫毛類(lèi)化妝品，主要成分是巰基乙酸(鈣)，其巰基可以與毛發(fā)中的蛋白結(jié)構(gòu)相結(jié)合，使毛發(fā)溶解，以達(dá)到脫毛的目的，尤其適合怕痛而肌膚不易過(guò)敏的人群，因此倍受青睞[1]。巰基乙酸易經(jīng)皮吸收，對(duì)人體產(chǎn)生較強(qiáng)的毒性。脫毛類(lèi)化妝品作為人們常用且用量大的化妝品，其巰基乙酸含量是否在安全范圍直接關(guān)系到使用者的健康，因此對(duì)脫毛類(lèi)化妝品中的巰基乙酸含量進(jìn)行準(zhǔn)確的測(cè)定顯得尤為重要[2-6]。通常，檢驗(yàn)檢測(cè)機(jī)構(gòu)采用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化妝品衛(wèi)生規(guī)范(2015版)中的高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)法測(cè)定化妝品中巰基乙酸的含量，該方法相對(duì)簡(jiǎn)單方便[7]。

為了評(píng)估HPLC方法中對(duì)檢測(cè)結(jié)果影響較大的不確定度因素，依據(jù)國(guó)家計(jì)量技術(shù)規(guī)范《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》(JJF 1059.1-2012)[8]的要求，對(duì)該方法測(cè)定結(jié)果的不確定度進(jìn)行分析，為評(píng)定檢測(cè)結(jié)果的可靠程度提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

巰基乙酸標(biāo)準(zhǔn)品(95.0%，加拿大Toronto Research Chemicals公司)；乙腈[色譜純，ThermoFisher科技(中國(guó))有限責(zé)任公司]；C8色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，大連伊利特公司)。

1.2 儀器與設(shè)備

Waters-2695型高效液相色譜儀，配有二極管陣列檢測(cè)器紫外檢測(cè)器(美國(guó)Waters公司)；XP205DR分析天平[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]；IKA MS3漩渦振蕩器[萊貝(上海)科學(xué)儀器有限公司]；MJ-300型超聲波清洗機(jī)(無(wú)錫市美極超聲設(shè)備有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

(1)標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制。準(zhǔn)確稱(chēng)取30 mg(精確到0.1 mg)巰基乙酸標(biāo)準(zhǔn)品于25 ml容量瓶中。用流動(dòng)相溶解并定容至刻度，配制成濃度為1200 μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。用流動(dòng)相將巰基乙酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液逐級(jí)稀釋成濃度分別為24 μg/ml、60 μg/ml、96 μg/ml、120 μg/ml以及180 μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

(2)試樣制備。精密稱(chēng)取0.25 g樣品于25 ml具塞離心管中，加少許乙腈+水(10+90)渦旋60 s使樣品分散，繼續(xù)加乙腈+水(10+90)定容至接近刻度，超聲15 min，取出，定容至25 ml刻度，搖勻，取上層溶液，用0.45 μm有機(jī)系濾膜過(guò)濾。根據(jù)需要進(jìn)行稀釋待測(cè)[9]。

(3)色譜條件。①色譜柱，伊利特C8 5μm，4.6 mm×250 mm；②流動(dòng)相，乙腈+0.01 mol/L KH2PO4(磷酸調(diào)至pH值為2.5)=(10＋90)；③流速，1 ml/min；進(jìn)樣量：10 μl；④柱溫，30 ℃；⑤檢測(cè)波長(zhǎng)，215 nm；⑥檢測(cè)器，二極管陣列檢測(cè)器-2998。

(4)數(shù)學(xué)模型的建立。巰基乙酸的計(jì)算為：

式中X為試樣中巰基乙酸含量，μg/kg；C為從標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)得到巰基乙酸的質(zhì)量濃度，μg/ml；V為樣品定容體積(ml)；m為樣品取樣量(g)。

(5)由于《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》(2015版)中第四章3.9巰基乙酸是使用標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法對(duì)試樣中巰基乙酸進(jìn)行定性和定量檢測(cè)，所以試樣測(cè)定結(jié)果的不確定度除C、V、m外，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)、試樣測(cè)量重復(fù)性、儀器進(jìn)樣重復(fù)性和回收率都對(duì)測(cè)定結(jié)果產(chǎn)生影響。則由上式可轉(zhuǎn)化為：

式中R為回收率，f重為重復(fù)性修正因子，f校為校正曲線(xiàn)擬合修正因子。

2 結(jié)果與分析

2.1 不確定度來(lái)源分析

從測(cè)量過(guò)程和數(shù)學(xué)模型分析，試樣測(cè)定的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度主要由標(biāo)準(zhǔn)溶液配制urel(C)、試樣稱(chēng)量urel(m)、試樣定容urel(V)、標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)擬合urel(C0)、試樣測(cè)量重復(fù)性u(píng)rel(R)以及儀器進(jìn)樣重復(fù)性u(píng)rel(Q)幾個(gè)方面引入[10]。

2.2 各分量相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度評(píng)定

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(C)標(biāo)準(zhǔn)溶液由巰基乙酸標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)過(guò)稱(chēng)量、定容及稀釋配制而成，所以標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過(guò)程引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度由標(biāo)準(zhǔn)品純度、天平稱(chēng)量、標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液定容和標(biāo)準(zhǔn)工作液稀釋而組成。

(1)標(biāo)準(zhǔn)品純度引入的不確定度urel(C1)。由巰基乙酸標(biāo)準(zhǔn)品證書(shū)可知，純度為95.0%，按均勻分布處理[11]。則其標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：=0.02887，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

(2)天平稱(chēng)量引入的不確定度urel(C2)。稱(chēng)取巰基乙酸標(biāo)準(zhǔn)品使用的電子天平的檢定證書(shū)給出在d=0.01 mg、0≤m≤5 g條件下，其最大允許誤差為±0.05 mg，按矩形分布考慮[10]其引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：=0.02887mg， 精確稱(chēng)量30 mg巰基乙酸標(biāo)準(zhǔn)品，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

(3)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液定容引入的不確定度urel(C3)。使用25 ml容量瓶定容巰基乙酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，依據(jù)JJG196-2006《常用玻璃量器檢定規(guī)程》[12]。20 ℃時(shí)25 ml容量瓶(A級(jí))的容量允差為±0.030 ml，按三角分布考慮，其標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：=0.01225ml ，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

巰基乙酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液由10%乙腈配制而成，20 ℃時(shí)玻璃的體積膨脹系數(shù)為(2.5×10-5)℃[13]。乙腈的體積膨脹系數(shù)為(1.4×10-3)℃，水的體積膨脹系數(shù)為(2.1×10-4)℃，則10%乙腈水的平均體積膨脹系數(shù)為(1.64×10-4)℃[14-15]。假設(shè)25 ml容量瓶的使用溫度與室溫一致，實(shí)驗(yàn)時(shí)室溫為23.9 ℃，則由校準(zhǔn)溫度與使用溫度不同引起的體積不確定值為：

ΔV=V1-V2=(α平均-α玻璃)×V×ΔT=0.01355ml

按三角分布考慮，使用25 ml容量瓶時(shí)，其標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：=0.005532ml，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

則合成標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液定容的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

(4)標(biāo)準(zhǔn)工作液稀釋urel(C4)。標(biāo)準(zhǔn)工作液由標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液分別稀釋配制而成，使用了規(guī)格分別為5～50μl、20～200μl、100～1000μl、100～5000μl的移液器和10 ml容量瓶。依據(jù)移液器校準(zhǔn)證書(shū)，當(dāng)k=2時(shí)，這3種規(guī)格移液器的擴(kuò)展不確定度依次為u(200 μl)=0.4 μl、u(1000 μl)=0.5 μl和u(5000 μl)=0.6 μl，則其標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為：

其各自相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度見(jiàn)表1。

表1 標(biāo)準(zhǔn)系列配制過(guò)程中移液器校準(zhǔn)引起的不確定度

使用10 ml容量瓶配制標(biāo)準(zhǔn)工作液，依據(jù)JJG196-2006《常用玻璃量器檢定規(guī)程》[12]。20 ℃時(shí)10 ml容量瓶(A級(jí))的容量允差為±0.020 ml，按三角分布考慮，其標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

巰基乙酸標(biāo)準(zhǔn)工作液由10%乙腈水配制而成，20 ℃時(shí)玻璃的體積膨脹系數(shù)為2.5×10-5/℃[13]；水的體積膨脹系數(shù)為2.1×10-4/℃[15]；乙腈的體積膨脹系數(shù)為1.4×10-3/℃，則10%乙腈水的平均體積膨脹系數(shù)為1.64×10-4/℃[14]。假設(shè)10 ml容量瓶的使用溫度與室溫一致，實(shí)驗(yàn)時(shí)室溫為23.9 ℃，則由校準(zhǔn)溫度與使用溫度不同引起的體積不確定值為：

按三角分布考慮，使用10 ml容量瓶時(shí)，其標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

則合成標(biāo)準(zhǔn)工作液稀釋過(guò)程的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

則合成標(biāo)準(zhǔn)溶液配制的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.2.2 試樣稱(chēng)量引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(m)

待測(cè)試樣同樣使用十萬(wàn)分之一天平進(jìn)行稱(chēng)量，根據(jù)電子天平檢定證書(shū)，在d=0.1 mg、0≤m≤50 g條件下，其最大允許誤差為±0.5 mg，按矩形分布考慮，其標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

稱(chēng)取試樣0.2515 g，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.2.3 試樣定容引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(V)

使用100～5000 μl移液器移取1500 μl流動(dòng)相定容試樣，依據(jù)移液器校準(zhǔn)證書(shū)，當(dāng)k=2時(shí)，U=0.6 μl，則其標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

則其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)擬合引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(C0)

測(cè)定過(guò)程中采用1200 μg/ml的巰基乙酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制成濃度分別為24 μg/ml、60 μg/ml、96 μg/ml、120 μg/ml和180 μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)工作液，將這5個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液分別上機(jī)檢測(cè)6次，測(cè)得的峰面積結(jié)果見(jiàn)表2。采用最小二乘法擬合，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的線(xiàn)性回歸方程為：Y=bX+a=4298.3X＋21958.2，相關(guān)系數(shù)r=0.9998，其中

峰面積測(cè)量的標(biāo)準(zhǔn)偏差為：

應(yīng)用該曲線(xiàn)進(jìn)行測(cè)量時(shí)，對(duì)被測(cè)試樣檢測(cè)10次，即p=10，測(cè)得試樣中巰基乙酸的濃度見(jiàn)表3。

由表3計(jì)算，試樣中巰基乙酸的平均濃度為32.085 μg/ml，試樣質(zhì)量以0.2515 g計(jì)，得到的試樣中巰基乙酸的最佳估計(jì)值為3.189 μg/kg。

校準(zhǔn)曲線(xiàn)擬合的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

式中S為峰面積測(cè)量的標(biāo)準(zhǔn)偏差，數(shù)值為1506.33；b為校準(zhǔn)曲線(xiàn)的斜率數(shù)值為4298.3；p為試樣測(cè)定次數(shù)，數(shù)值為10；n為校準(zhǔn)溶液的測(cè)定次數(shù)，數(shù)值為30；Sxx為標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度殘差的平方和，數(shù)值為84672；C0為試樣中巰基乙酸的平均濃度，數(shù)值為32.085 μg/ml；C 為巰基乙酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均濃度，數(shù)值為96 μg/ml。

標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)擬合的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.2.5 試樣測(cè)量重復(fù)性引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(R)

對(duì)3.0 μg/kg濃度添加的試樣進(jìn)行10次平行測(cè)定，所得結(jié)果見(jiàn)表4。

為確定回收率校準(zhǔn)因子f重是否在計(jì)算公式中采用，對(duì)平均回收率進(jìn)行了顯著性檢驗(yàn)[10-11，13]。顯著性檢驗(yàn)采用t檢驗(yàn)，當(dāng)檢驗(yàn)值t大于或等于臨界值t(95，10)=2.23[10-11，13]時(shí)，則平均回收率與100%有顯著性差異，表明校準(zhǔn)因子必須在計(jì)算公式中采用，用于修正結(jié)果，否則不采用。

本實(shí)驗(yàn)t值為0.126，小于臨界值2.23，表明平均回收率與100%無(wú)差異顯著，在計(jì)算公式中可忽略校準(zhǔn)因子。試樣測(cè)量重復(fù)性引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.2.6 儀器引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(Q)

對(duì)濃度為120 μg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行6次重復(fù)測(cè)定，所得峰面積見(jiàn)表5。

表2 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)擬合數(shù)據(jù)

表3 試樣液中巰基乙酸濃度結(jié)果

表4 試樣重復(fù)性測(cè)量結(jié)果

表5 重復(fù)進(jìn)樣測(cè)量結(jié)果

單個(gè)峰面積的標(biāo)準(zhǔn)偏差為：

試樣測(cè)定平均值的A類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.3 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度評(píng)定

根據(jù)各分量相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度的評(píng)定，歸納出不確定度的分量、來(lái)源及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度見(jiàn)表6[12-13]。

由表6，合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

表6 相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度總結(jié)

試樣中巰基乙酸含量的合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

u(X)=X·urel=3.189μg/kg×0.03180=0.1014μg/kg

通過(guò)對(duì)脫毛類(lèi)化妝品中巰基乙酸含量的不確定度各分量的評(píng)定，由表6的數(shù)據(jù)可以看出：標(biāo)準(zhǔn)溶液配制、試樣測(cè)量重復(fù)性以及儀器進(jìn)樣重復(fù)對(duì)結(jié)果的影響較大；其次是標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)擬合和試樣稱(chēng)量；試樣定容引入的不確定度極小，可以忽略不計(jì)。

2.4 擴(kuò)展不確定度評(píng)定

擴(kuò)展不確定度由合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度乘以包含因子得到，取置信水平95%，則k=2，脫毛類(lèi)化妝品中巰基乙酸含量的擴(kuò)展不確定度為：

用高效液相色譜法測(cè)定脫毛類(lèi)化妝品中巰基乙酸含量，當(dāng)取樣量為0.25g，k=2(置信水平95%)時(shí)，測(cè)得脫毛類(lèi)化妝品中巰基乙酸含量為(3.189±0.2028)μg/kg。

3 結(jié)論

通過(guò)使用高效液相色譜法對(duì)脫毛類(lèi)化妝品中巰基乙酸含量的不確定度各分量的測(cè)定，從最終數(shù)據(jù)分析，影響檢測(cè)結(jié)果的三大因素由大到小依次為標(biāo)準(zhǔn)溶液配制(B類(lèi)評(píng)定)、試樣測(cè)量重復(fù)性(A類(lèi)評(píng)定)及標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)擬合(A類(lèi)評(píng)定)；其次是儀器進(jìn)樣重復(fù)(A類(lèi)評(píng)定)和試樣稱(chēng)量(B類(lèi)評(píng)定)；試樣定容(B類(lèi)評(píng)定)引入的不確定度極小，可以忽略不計(jì)。從評(píng)定類(lèi)型分析，六大分量中B類(lèi)評(píng)定所占不確定度比A類(lèi)評(píng)定小，B類(lèi)評(píng)定不確定度主要來(lái)源于校準(zhǔn)證書(shū)、廠(chǎng)家說(shuō)明書(shū)、第三方權(quán)威機(jī)構(gòu)發(fā)布的量值等客觀(guān)因素，A類(lèi)評(píng)定不確定度主要來(lái)源于多次測(cè)量所得量值等主觀(guān)操作[16]。

為提高檢測(cè)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，在實(shí)際的檢驗(yàn)檢測(cè)過(guò)程中可通過(guò)提高標(biāo)準(zhǔn)品純度、調(diào)整實(shí)驗(yàn)環(huán)境溫度以及使用精確的移液量器來(lái)減小標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)配制過(guò)程中產(chǎn)生的誤差；可通過(guò)依據(jù)樣品實(shí)際濃度合理設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)、增加標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)各濃度點(diǎn)的測(cè)定次數(shù)來(lái)減小標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)擬合產(chǎn)生的不確定度；試樣前處理操作過(guò)程中產(chǎn)生的誤差可通過(guò)制定規(guī)范的實(shí)驗(yàn)操作規(guī)程以及使用檢定合格的計(jì)量器具，盡量減小干擾，從而保證檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性[10]。