王京萍，曾令公，武世伍，馬 莉，柴大敏

(蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院臨床病理科，蚌埠醫(yī)學院病理學教研室，安徽 蚌埠 233000)

1 自噬概述

“Autophagy”即自噬，這個詞是de Duve等[1]于1966年發(fā)現(xiàn)溶酶體的同時創(chuàng)造出來的，描述的是具有單層或雙層膜的結構吞噬受損的蛋白質(zhì)和細胞器等功能失調(diào)的細胞組分形成自噬體，之后與溶酶體融合形成自噬溶酶體，最后將包裹物降解的一個過程。通過自噬降解的包裹物包括糖、核苷酸、氨基酸和脂肪酸，最終自噬體會同溶酶體進行融合進而將細胞器降解，這一過程可以為細胞提供大量的營養(yǎng)物質(zhì)以及用于細胞再生的結構基礎。直到1992年Takeshige等[2]首次報道營養(yǎng)缺乏條件下誘導酵母細胞液中細胞成分的廣泛自噬降解，才鑒定出自噬機制中涉及的分子，并在隨后研究中闡明酵母細胞中自噬發(fā)生的分子機制并且將自噬相關基因統(tǒng)一命名為ATG(autophagy-related genes)。

1999年Liang 等[3]鑒定出的beclin-1(也稱為ATG6)是第1個被發(fā)現(xiàn)的具有介導自噬作用的哺乳動物基因，強制表達自噬基因不僅促進營養(yǎng)剝奪誘導人乳腺癌細胞的自噬，而且抑制其腫瘤形成潛力，表明自噬可能是防止腫瘤細胞失調(diào)生長的基本機制；自噬作為應激反應機制保護癌細胞免受低營養(yǎng)供應或治療的損傷，還通過觸發(fā)非凋亡性細胞死亡程序參與癌細胞的消除，在腫瘤發(fā)展中具有負面作用；另一方面，越來越多的證據(jù)表明自噬在腫瘤的發(fā)展過程中起著促進作用，當腫瘤細胞在能量不足、缺氧和生長因子缺失等應激條件下，自噬可以對細胞內(nèi)損傷的蛋白質(zhì)和細胞器進行吞噬降解，這一過程可以為腫瘤細胞提供能量[4]。從目前所知自噬與腫瘤之間存在著雙重的關系，如何使用好這把“雙刃劍”使其在腫瘤治療中將傷害降到最小化，我們還需更深入探討自噬的功能。

1.1自噬的分型和功能 自噬主要有3種類型：巨自噬、微自噬和伴侶介導自噬，其中巨自噬被認為在細胞內(nèi)降解中起主要作用，目前所說自噬即巨自噬。自噬是細胞降解并回收細胞成分的穩(wěn)態(tài)過程，可以作為細胞存活和細胞死亡之間的平衡機制，自噬是通過在饑餓條件下使用細胞內(nèi)資源而在細胞存活中起作用的。這種動態(tài)過程包括隔離膜的形成，隔離膜的成核，延伸以及細胞成分的吞沒及雙膜的封閉4個步驟。調(diào)控自噬的分子機制是高度保守的，在酵母中它的調(diào)控機制也證實與哺乳動物細胞中保持高度一致[5]。

自噬過程是由一系列ATG嚴格調(diào)控，是一種動態(tài)細胞再循環(huán)系統(tǒng)，可降解細胞質(zhì)內(nèi)容物、異常蛋白質(zhì)聚集體以及過量或受損的細胞器，從而可以使用氨基酸等構建模塊來創(chuàng)建新的細胞成分。當待降解的蛋白質(zhì)、細胞器或細胞質(zhì)內(nèi)容物被一小部分膜包圍時，就會發(fā)生自噬，從而形成自噬體。然后將自噬體與溶酶體融合，產(chǎn)生自噬溶酶體并通過溶酶體酶導致細胞組分降解。其中自噬的核心部分是自噬體，就是由膜運輸介導的獨特的雙膜結構，同時也是檢測自噬發(fā)生的金指標之一。自噬通常通過營養(yǎng)缺乏的條件激活，但也與生理以及病理過程相關，例如發(fā)育、分化、神經(jīng)變性疾病、壓力、感染、肥胖和腫瘤；一方面自噬可以通過促進蛋白質(zhì)分解代謝為腫瘤細胞及時提供能量而延長腫瘤細胞的壽命；而另一方面過度的自噬會引起自噬性程序性細胞死亡，即Ⅱ型程序性細胞死亡，從而起到抑制腫瘤生長的作用[6-7]。

1.2自噬的過程 自噬的分子機制主要在酵母中發(fā)現(xiàn)，并由許多ATG指導[8]。UNC-51樣蛋白激酶(UNC-51-like kinase 1, ULK-1)起到與酵母ATG1相似的作用，其作用于哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(the mammalian target of rapamycin，mTOR)復合物的下游[9]。ULK與ATG13和支架蛋白FIP200形成大的復合物。ATG通過ATG12-ATG5和微管相關蛋白1輕鏈3-B(microtubule-associated proteein 1 light chain 3-B，LC3-B)復合物控制自噬體形成。ATG12在泛素樣反應中與ATG5綴合，這一過程需要ATG7和ATG10的參與；然后，ATG12-ATG5綴合物與ATG16非共價結合形成大的復合物。第2種復合物LC3/ATG8在其C末端被ATG4蛋白酶切割以產(chǎn)生胞質(zhì)LC3-A。 LC3-A與泛素樣反應中的磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine，PE)綴合，這一過程需要ATG7和ATG3的參與，即LC3-B以脂質(zhì)形式附著于自噬體膜。Sequestosome 1是一種由SQSTM1基因編碼的蛋白質(zhì)，也被稱為泛素結合蛋白p62(SQSTM1/p62)是一種結合LC3/ATG8的泛素結合蛋白，通過將含有SQSTM1/p62的蛋白質(zhì)聚集體帶到自噬體中來促進自噬，從而完成降解[10]，見圖1。

Figure 1.The basic processes of autophagy and related pathways.

圖1 自噬的基本過程和有關通路

1.3自噬的調(diào)控 LC3存在于胞質(zhì)中，LC3-B始終穩(wěn)定地黏附在自噬體膜上，直到自噬體與溶酶體相融合，因此相對于LC3-A，LC3-B更穩(wěn)定，可以作為自噬體的標志物。磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylino-sitol 3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，PKB，即Akt)/mTOR信號通路在眾多細胞生物學過程中均起到至關重要的作用，包括細胞凋亡、自噬、代謝及血管新生。mTOR是自噬誘導的關鍵調(diào)節(jié)因子，其中活化的mTOR[Akt和絲裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號傳導]抑制自噬，并且mTOR的負調(diào)節(jié)(AMPK和p53信號傳導)促進其自噬[11]。雷帕霉素(rapamycin)是mTOR的特異性抑制劑，沉默或抑制mTOR激酶的活性可以增強雷帕霉素的抗腫瘤作用[12]。

2 自噬與神經(jīng)膠質(zhì)瘤

2.1神經(jīng)膠質(zhì)瘤的標準化治療 腫瘤是由于調(diào)節(jié)細胞分化、增生和存活通路的失調(diào)節(jié)引起的。神經(jīng)膠質(zhì)瘤是來源于神經(jīng)上皮的一種最常見的腫瘤，占所有原發(fā)性腦和中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的24%。這些腫瘤在組織學上差異很大，從良性室管膜瘤到最具攻擊性和致命性的IV級多形性膠質(zhì)母細胞瘤(glioblastoma multiforme，GBM)。毛細胞型神經(jīng)膠質(zhì)瘤預后尚好，10年生存率可以達到90%；但是由于GBM生長呈侵襲性，極易復發(fā)、遷移，平均生存時間僅為15～18個月，患者5年生存率僅為5%[13]。目前較成熟的治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤的化療方案有以下2種：(1)檢測O6-甲基鳥嘌呤DNA甲基轉移酶(O6-methylguanine-DNA methyltransferase，MGMT)甲基化以預測替莫唑胺療效；(2)染色體1p/19q雜合性缺失(1p/19qLOH)，預測PCV(環(huán)己亞硝脲+長春新堿+甲基芐肼)方案(應用最廣的療效最確切的腦膠質(zhì)瘤化療方案)預后好。

在美國和其它一些國家，使用貝伐單抗進行抗血管生成治療被批準用于治療復發(fā)性GBM[14]。最大安全性開顱手術、輔助放療和替莫唑胺用于新診斷的GBM，貝伐單抗用于復發(fā)性GBM。美國食品和藥物管理局批準的唯一針對膠質(zhì)瘤的靶向治療是貝伐單抗，其靶向血管內(nèi)皮生長因子，初步研究顯示貝伐單抗具有高放射學反應率，可延長無進展生存期(progression-free survival，PFS)。雖然在整體人群中沒有觀察到貝伐單抗的生存獲益，但事后亞組分析確認，為異檸檬酸脫氫酶1(isocitrate dehydrogenase 1, IDH1)野生型GBM亞組添加貝伐單抗后中位生存期可能增加4.3個月[15]。目前在國內(nèi)乃至國際上關于貝伐單抗的使用依然充滿爭議。

2.2自噬相關的神經(jīng)膠質(zhì)瘤的分子生物學研究 目前與自噬相關的神經(jīng)膠質(zhì)瘤的分子生物學研究有如下3種：(1)TP53突變，在星形細胞瘤起源的膠質(zhì)瘤中，TP53基因突變率達65%以上；(2)表皮生長因子受體Ⅷ(epidermal growth factor receptor，EGFRⅧ)，采用特異性EGFRⅧ單抗檢測高級別膠質(zhì)瘤，作為靶向治療的突破，EGFRⅧ第3階段實驗失敗，疫苗正在研發(fā)；(3)IDH1，80%以上的低級別膠質(zhì)瘤存在IDH1基因第132位點雜合突變。膠質(zhì)瘤的放療、化療和光療均涉及自噬。詳細闡明細胞自噬機制，開發(fā)新的自噬誘導劑或抑制劑以及應用策略促使膠質(zhì)瘤細胞發(fā)生自噬性死亡，已經(jīng)成為膠質(zhì)瘤治療的新方向。

據(jù)報道，與低級星形細胞瘤和正常腦組織相比，GBM中beclin-1和LC3-B水平降低，這表明降低的自噬活性可能促使這些腫瘤進展為更惡性的表型，GBM中beclin-1基因的缺失支持了自噬在該腫瘤發(fā)生中起抑制作用的理論[16]。

2.3自噬相關神經(jīng)膠質(zhì)瘤的體外研究 有實驗證實，膠質(zhì)瘤和GBM細胞在暴露于電離輻射后表現(xiàn)出對細胞凋亡的強烈抵抗，凋亡相關基因如第10號染色體缺失性磷酸酶-張力蛋白同源蛋白(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10，PTEN)的表達狀態(tài)可能與該現(xiàn)象有關，并且干擾各種信號通路[17]。如上所述，PI3K/Akt/mTOR被認為是調(diào)節(jié)自噬的主要途徑，通過使用Akt/mTOR抑制劑如雷帕霉素類似物抑制 Akt/mTOR活性，加劇了自噬過程[18]。雷帕霉素對氧糖剝奪損傷的人神經(jīng)母細胞瘤SH-SY5Y細胞具有保護作用，這一過程與激活自噬相關[19]。Akt抑制劑在放射抗性和放射敏感性U87膠質(zhì)瘤細胞系中誘導自噬死亡，并增強對輻射的敏感性，但不誘導細胞凋亡[20]。還有各種研究著重于自噬抑制的神經(jīng)膠質(zhì)瘤放射敏感性：Yuan等[21]的研究表明，使用siRNA抑制ATG5或使用3-甲基腺嘌呤抑制自噬可增強STAT3抑制后神經(jīng)膠質(zhì)瘤的放射敏感作用。

2017年Jiang等[22]進行體外和體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)鹽酸青藤堿(sinomenine hydrochloride，SH)通過活性氧物質(zhì)生成和自噬-溶酶體途徑激活而抑制人GBM細胞生長；在2種細胞系均發(fā)現(xiàn)SH參與活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)產(chǎn)生和自噬-溶酶體途徑激活，并通過Akt-mTOR和c-Jun氨基末端激酶(c-Jun NH2-terminal kinase，JNK)通路來誘導自噬發(fā)生，從而抑制GBM細胞生長。2017年Duan等[23]在U87MG細胞系中發(fā)現(xiàn)沉默自噬特異性基因beclin-1有助于減弱神經(jīng)膠質(zhì)瘤中缺氧誘導的血管生成擬態(tài)。2018年Navone等[24]研究發(fā)現(xiàn)阿司匹林可以影響腫瘤血管生成并使人GBM內(nèi)皮細胞對替莫唑胺、貝伐單抗和舒尼替尼敏感，從而損害VEGF相關信號傳導。2018年Zhao等[25]研究發(fā)現(xiàn)腺相關病毒2介導血管內(nèi)皮生長因子陷阱的基因轉移可以作為膠質(zhì)瘤的一種新的治療選擇。這些發(fā)現(xiàn)也提供了一個用于治療人GBM的新型潛在治療劑。

2.4自噬相關神經(jīng)膠質(zhì)瘤的臨床研究 BriceZo 等[26]在2003年進行了第一批臨床試驗，他們將18例患有膠質(zhì)母細胞瘤且均接受手術、化療和放療的患者分成2組進行臨床用藥治療，實驗組每天服用150 mg的氯喹(一種自噬抑制劑)，同對照組相比實驗組有明顯較長的中位生存期[實驗組(33±5)個月，對照組(11±2)個月]，并在2006年繼續(xù)進行臨床研究，在123名患有GBM的患者中讓其自由選擇接受氯喹作為任選的輔助治療，同時進行常規(guī)手術、化療和放療，共有41名患者參與到實驗組，氯喹在加入GBM的常規(guī)治療時發(fā)揮強烈的佐劑作用[氯喹治療組患者的生存時間為(25.0±3.4)個月，而對照組為(11.4±1.3)個月][27]。隨后，Golden等[28]和Lee等[29]再次印證了這一觀點并為其找出了理論依據(jù)，即替莫唑胺和氯喹聯(lián)合治療的協(xié)同作用依賴于自噬形成和膠質(zhì)瘤細胞中的p53狀態(tài)。干擾性自噬可能確實在治療膠質(zhì)瘤和GBM方面有所作為。圖2所示為一種假設的方案，主要針對替莫唑胺聯(lián)合放射治療期間GBM致敏的自噬[30]。其中，功能性自噬死亡是指由于溶酶體潛能耗盡而導致的過度自噬活動之后的死亡；非功能性自噬死亡指的自噬體與溶酶體無法融合導致自噬體無法承受的累積之后的死亡；細胞凋亡即Ⅰ型程序性死亡，是由DNA或膜損傷引發(fā)從線粒體釋放半胱天冬酶導致的死亡。

Figure 2.Autophagy for glioblastoma sensitization during temozolomide and radiotherapy.

圖2 關于替莫唑胺聯(lián)合放射治療期間膠質(zhì)母細胞瘤致敏的自噬

目前在臨床實驗研究官網(wǎng)上可以找到的臨床實驗研究包含5項(autophagy and gliomas;http://clinicaltrials.gov)：(1)HIT-HGG研究組在兒童和青少年中用于治療高級別神經(jīng)膠質(zhì)瘤、彌漫性腦橋腦膜瘤和腦膠質(zhì)瘤的國際合作型III期試驗，分別設置替莫唑胺聯(lián)合氯喹和替莫唑胺聯(lián)合丙戊酸的試驗，屬于第3階段試驗(編號NCT03243461)；(2)在惡性膠質(zhì)瘤放化療中加入氯喹，在新診斷的GBM的同步化放療時加入氯喹，II期隨機對照實驗(編號NCT02432417)；(3)四氫大麻酚+大麻二酚(tetrahydrocannabinol +cannabidiol，THC+CBD/TN-TC11G)聯(lián)合替莫唑胺加放療用于治療新診斷的GBM，是內(nèi)部劑量遞增臨床試驗，現(xiàn)處于I期，評估TN-TC11G(THC+CBD)聯(lián)合替莫唑胺和放射治療新診斷GBM患者的安全性(編號NCT03529448)；(4)DNX2401和替莫唑胺治療復發(fā)性GBM，DNX2401(以前命名的Delta-24-RGD或tasadenoturev，是一種腫瘤選擇性的，具有復制能力的溶瘤腺病毒)溶瘤腺病毒聯(lián)合替莫唑胺，治療第一次復發(fā)的GBM，I期試驗(編號NCT01956734)；(5)加入氯喹用于新診斷的GBM的同步化放療，I期試驗(編號NCT02378532)。

3 展望

一方面，抑制自噬已經(jīng)展現(xiàn)出一些前景研究結果，但神經(jīng)母細胞瘤中明顯的腫瘤抑制作用的自噬會提示誘導自噬將是一種更實際的治療方法，特別是在這些細胞凋亡有缺陷時。此外，如果說誘導自噬在促進免疫系統(tǒng)中發(fā)揮實際作用的話，抑制自噬則有破壞免疫監(jiān)視的風險。因此，我們想要更深入了解癌癥干細胞及其在癌癥進展及復發(fā)中的作用，那么對于膠質(zhì)瘤干細胞中的自噬過程進行全面分析是非常必要的，可能因此就可以把握改善患者預后的關鍵點。然而，必須解決的一個關鍵問題是放射療法和替莫唑胺是否會引發(fā)功能性自噬反應，或者它們只是解除了自噬導致的不可降解的自噬體積聚。這需要在使用遞增劑量的放射療法或替莫唑胺后監(jiān)測細胞系中自噬流和溶酶體動力學的研究，因為劑量方案可能是定義自噬反應類型的主要因素。

當前新的放射治療技術允許每個部分向腫瘤遞送高劑量，同時減少對周圍正常腦組織的劑量。即使在放射抗性細胞系中，阻斷自噬通量的大分割是否可以與晚期自噬阻滯劑有效結合以利用非功能性自噬死亡是一個值得研究的問題。替莫唑胺是與放療聯(lián)合使用時發(fā)揮作用，還是只針對放療后復發(fā)的腫瘤，其機制是不是同放射治療引起膠質(zhì)瘤細胞自噬死亡一樣？在標準放療期間或放射治療失敗后，mTOR抑制劑(或增強劑)與低劑量替莫唑胺的組合，會引發(fā)功能性自噬死亡，也可能是一種有前景的方法。放療與替莫唑胺聯(lián)合對于自噬反應的調(diào)節(jié)似乎是延長生存和更好地理解GBM治療之謎的最有希望的方法之一，但仍然缺少需要創(chuàng)建可靠概念的重要見解。

由于自噬與腫瘤之間存在著雙重的關系，我們應選取自噬抑制劑還是促進劑應用到神經(jīng)膠質(zhì)瘤的治療中，怎樣消除自噬對腫瘤細胞的能量提供，怎樣誘發(fā)自噬性細胞死亡，都是亟待解決的關鍵問題。關于自噬在神經(jīng)膠質(zhì)瘤的具體機制，還需要更透徹的研究。