付學(xué)東，劉 巍，何秉燕，王捷榮，鄧幼平

(武漢大學(xué)中南醫(yī)院兒科，湖北 武漢 430071)

胰島素抵抗是糖尿病患者標(biāo)志性、特征性事件，在糖尿病(尤其是2型糖尿病)的發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用[1-2]。因此，探尋具有改善胰島素抵抗作用的生物活性分子，揭示其潛在的分子機(jī)制，將有助于加深對(duì)糖尿病發(fā)生、發(fā)展分子機(jī)制的認(rèn)識(shí)，并有可能為糖尿病的治療提供新的作用靶點(diǎn)。淫羊藿苷(icariin,ICA)是從淫羊藿草中分離得到的異戊烯基黃酮醇苷，具有多種生物學(xué)效應(yīng)[3]。近年來有文獻(xiàn)報(bào)道，淫羊藿苷具有調(diào)節(jié)胰島素敏感性和脂質(zhì)代謝的作用[4-5]，因而有可能被用于糖尿病及其相關(guān)疾病的防治[6-7]。盡管如此，對(duì)淫羊藿苷抗胰島素抵抗的分子機(jī)制仍缺乏深入的了解。本研究利用高糖誘導(dǎo)C2C12肌管細(xì)胞產(chǎn)生胰島素抵抗，觀察淫羊藿苷對(duì)高糖誘導(dǎo)的肌細(xì)胞胰島素抵抗的影響，并探討其可能的機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 細(xì)胞與實(shí)驗(yàn)條件

C2C12小鼠成肌細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)模式菌種收集中心(American Type Culture Collection，ATCC)，在含10% 胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)和1% 青霉素/鏈霉素(penicillin/streptomycin，P/S)的DMEM培養(yǎng)液，于37°C、5% CO2條件下培養(yǎng) 。經(jīng)分化培養(yǎng)液(含0.1% FBS、1% P/S和1 mmol/L 胰島素的DMEM)培養(yǎng)72 h，C2C12成肌細(xì)胞被誘導(dǎo)分化為C2C12肌管細(xì)胞[8]。25 mmol/L 葡萄糖被用于誘導(dǎo)胰島素抵抗；5.5 mmol/L 葡萄糖作為對(duì)照，并加入19.5 mmol/L的甘露醇以避免滲透壓對(duì)細(xì)胞的可能影響。

為探討淫羊藿苷對(duì)高糖誘導(dǎo)的胰島素抵抗的影響，實(shí)驗(yàn)分為：正常糖對(duì)照(control,Con)組、正常糖+胰島素處理(control+insulin, Con+INS)組、高糖+胰島素處理(high glucose+insulin,HG+INS)組及高糖+淫羊藿苷+胰島素處理(high glucose+icariin+insulin, HG+ICA+INS)組。

已有研究表明，淫羊藿苷改善正常C2C12肌管細(xì)胞胰島素信號(hào)的有效工作濃度為50～100 μmol/L[5]。因此，在本文的劑量研究中，淫羊藿苷的工作濃度分別為25 μmol/L、50 μmol/L及75 μmol/L，作用時(shí)間為24 h。在時(shí)間效應(yīng)的研究中，淫羊藿苷的工作濃度50 μmol/L，作用時(shí)間分別為12 h、24 h及36 h。根據(jù)時(shí)間和劑量效應(yīng)的研究結(jié)果，確定其后的機(jī)制研究中淫羊藿苷處理?xiàng)l件為：濃度50 μmol/L、作用時(shí)間24 h。為觀察胰島素信號(hào)的變化，細(xì)胞在無血清處理的條件下，經(jīng)100 nmol/L的胰島素處理10 min。

在p38 MAPK抑制劑實(shí)驗(yàn)中，無血清處理的C2C12肌管細(xì)胞接受10 μmol/L的p38 MAPK特異性抑制劑SB203580處理1 h，再經(jīng)50 μmol/L的淫羊藿苷處理24 h，隨后接受100 nmol/L的胰島素處理10 min。

2 主要試劑

DMEM液體培養(yǎng)液、FBS和P/S等購(gòu)自Gibco；淫羊藿苷、p38 MAPK抑制劑SB203580和DMSO購(gòu)自Sigma-Aldrich；p38 MAPK 小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA) 、對(duì)照 siRNA和各種抗體均購(gòu)自Cell Signaling Technology；Glucose Uptake Assay Kit(Colorimetric)購(gòu)自Abcam。

3 主要方法

3.1細(xì)胞質(zhì)膜的分離 按文獻(xiàn)方法，離心分離細(xì)胞質(zhì)膜[9]。方法簡(jiǎn)述如下：細(xì)胞在含10 mmol/L Tris-HCl(pH=7.8)、10 mmol/L KCl、1.5 mmol/L MgCl2、1 mmol/L苯基甲基磺酰氟、0.5 mmol/L二硫蘇糖醇、5 mg/L抑肽酶、10 mg/L亮抑酶肽及0.1% Noni-det P-40的緩沖液裂解，4 ℃、1 000×g離心2次，每次10 min；得到的沉淀重懸于含有1% Nonidet P-40的緩沖液中，并在4 ℃、10 000×g離心20 min，得到質(zhì)膜部分。Western blot法觀察葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4(glucose transporter 4,GLUT4)的表達(dá)，膜特異性蛋白cadherin 檢測(cè)質(zhì)膜分析的有效性。

3.2siRNA轉(zhuǎn)染 使用Lipofectamine RNAiMAX轉(zhuǎn)染試劑(Invitrogen)轉(zhuǎn)染細(xì)胞，siRNA使用濃度為120 pmol/L，具體操作嚴(yán)格按試劑說明書進(jìn)行，Western blot法評(píng)估轉(zhuǎn)染效率。

3.3葡萄糖攝取 細(xì)胞葡萄糖攝取量測(cè)定采用Glucose Uptake Assay Kit (Colorimetric)，按說明書操作。

3.4Western blot實(shí)驗(yàn) 用于檢測(cè)蛋白或磷酸化蛋白的表達(dá)，方法簡(jiǎn)述如下：實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，除去培養(yǎng)液，冰冷的PBS洗滌細(xì)胞，細(xì)胞經(jīng)裂解緩沖液[含20 mmol/L HEPES(pH=7.9)、 350 mmol/L NaCl、500 mmol/L KCl、0.5 mmol/L EDTA、0.5 mmol/L EGTA、1 mmol/L MgCl2、10% 甘油、1% Nonidet P-40、10 mmol/L NaF、0.1 mmol/L NaV、8 mmol/L β-甘油磷酸酯、磷酸酶抑制劑混合物I和II (Sigma-Aldrich)]裂解；其后，10 000×g、4 ℃離心10 min，分離保留上清，BCA(bicinchonininc acid)法測(cè)定蛋白濃度，并調(diào)整蛋白濃度為2 g/L；加入等量的2×SDS 上樣緩沖液，100 ℃加熱10 min，10 000×g、4 ℃離心10 min，取上清用于SDS-PAGE 分離蛋白,轉(zhuǎn)移蛋白到硝化纖維素膜,并用特異性抗體檢測(cè)蛋白或磷酸化蛋白的表達(dá)。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用XLSTAT Premium 2018軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)4次，并具有類似的結(jié)果。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。單因素方差分析(one-way ANOVA)對(duì)組間差異進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 淫羊藿苷減輕高糖誘導(dǎo)的C2C12肌管細(xì)胞胰島素抵抗

與正常糖對(duì)照組比較，高糖降低了Akt T308的磷酸化水平，而淫羊藿苷可阻止高糖誘導(dǎo)的Akt T308磷酸化水平降低。具體表現(xiàn)為，以25、50和75 μmol/L的淫羊藿苷處理細(xì)胞24 h，可見淫羊藿苷以劑量依賴方式提高Akt T308磷酸化(P<0.05或P<0.01)；而以50 μmol/L的淫羊藿苷處理細(xì)胞12、24和36 h，可見淫羊藿苷以時(shí)間依賴方式提高Akt T308磷酸化 (P<0.05或P<0.01)，見圖1。此外，與正常糖對(duì)照組比較，高糖顯著降低了胰島素刺激所致的GLUT4質(zhì)膜轉(zhuǎn)位和細(xì)胞對(duì)2-脫氧葡萄糖(2-deoxyglucose, 2-DG)的攝取(P<0.01)，而淫羊藿苷可抑制高糖對(duì)GLUT4質(zhì)膜轉(zhuǎn)位和細(xì)胞對(duì)2-DG攝取的影響(P<0.01)，見圖2。

Figure 1. The impacts of icariin (ICA) on insulin (INS)-stimulated Akt T308 phosphorylation in C2C12 myotubes treated with high glucose (HG). A: the dose-dependent response; B: the time-dependent response. Mean±SD.n=4.**P<0.01vscontrol (Con) group;#P<0.05,##P<0.01vsHG+INS group.

圖1 淫羊藿苷對(duì)高糖處理的C2C12肌管細(xì)胞Akt T308磷酸化的影響

Figure 2. The impacts of icariin (ICA) on insulin (INS)-stimulated GLUT4 translocation on plasma membrane (A) and 2-deoxyglucose (2-DG) uptake (B) in C2C12 myotubes treated with high glucose (HG). Mean±SD.n=4.**P<0.01vsCon+INS group;##P<0.01vsHG+INS group.

圖2 淫羊藿苷對(duì)高糖處理的C2C12肌管細(xì)胞GLUT4質(zhì)膜轉(zhuǎn)位和2-DG攝取的影響

2 淫羊藿苷提高p38 MAPK磷酸化

與正常糖對(duì)照組比較，高糖顯著降低了胰島素刺激所致的p38 MAPK磷酸化(P<0.01)；而淫羊藿苷可抑制高糖對(duì)p38 MAPK磷酸化的影響(P<0.01)。此外，我們還觀察到，p38 MAPK磷酸化和Akt T308磷酸化的變化方向相一致，見圖3。

Figure 3.The impacts of icariin (ICA) on insulin (INS)-stimulated p38 MAPK phosphorylation in C2C12 myotubes treated with high glucose (HG). Mean±SD.n=4.**P<0.01vsCon+INS group;##P<0.01vsHG+INS group.

圖3 淫羊藿苷對(duì)高糖處理的C2C12肌管細(xì)胞p38 MAPK磷酸化的影響

3 抑制p38 MAPK降低淫羊藿苷對(duì)高糖誘導(dǎo)的胰島素抵抗的抑制作用

p38 MAPK特異性抑制劑SB203580消除了淫羊藿苷對(duì)p38 MAPK和Akt T308磷酸化、GLUT4質(zhì)膜轉(zhuǎn)位及細(xì)胞2-DG攝取的影響(P<0.01)，見圖4。 此外，我們還觀察到，p38MAPKsiRNA可有效降低p38 MAPK的蛋白表達(dá)，并顯著抑制淫羊藿苷對(duì)高糖作用下Akt T308磷酸化、GLUT4質(zhì)膜轉(zhuǎn)位及細(xì)胞對(duì)2-DG攝取的影響(P<0.05或P<0.01)，見圖5。

Figure 4.The inhibitor of p38 MAPK, SB203580 (SB), abolished the inhibitory effects of icariin (ICA) on high glucose (HG)-induced insulin (INS) resistance in C2C12 myotubes. A: Akt T308 and p38 MAPK phosphorylation; B: GLUT4 translocation on plasma membrane; C: 2-DG uptake. Mean±SD.n=4.**P<0.01vsHG+INS group;##P<0.01vsHG+ICA+INS group.

圖4 p38 MAPK抑制劑降低淫羊藿苷對(duì)高糖誘導(dǎo)C2C12肌管細(xì)胞胰島素抵抗的抑制作用

Figure 5.Thep38MAPKknockdown abolished the inhibitory effects of icariin (ICA) on high glucose (HG)-induced insulin (INS) resistance in C2C12 myotubes. A: Akt T308 phosphorylation; B: GLUT4 translocation on plasma membrane; C: 2-DG uptake. Mean±SD.n=4.*P<0.05,**P<0.01vsHG+INS group;#P<0.05,##P<0.01 HG+ICA+INS group.

圖5 敲減p38MAPK降低淫羊藿苷對(duì)高糖誘導(dǎo)C2C12肌管細(xì)胞胰島素抵抗的抑制作用

討 論

Akt是胰島素信號(hào)通路中的重要信號(hào)分子，其磷酸化和活性直接受到胰島素刺激的調(diào)節(jié)，同時(shí)也參與了對(duì)胰島素功能的調(diào)控。研究表明，Akt可在Thr308 (T308)和 Ser473(S473)2個(gè)位點(diǎn)發(fā)生磷酸化；其中，T308位點(diǎn)的磷酸化直接受控于胰島素激活的PDK1[5]。因此，Akt T308磷酸化的變化可直接反映胰島素信號(hào)系統(tǒng)的功能狀態(tài)。在本研究中，高糖顯著降低了胰島素刺激的Akt T308磷酸化，而淫羊藿苷可以在高糖作用下以劑量和時(shí)間依賴方式提高C2C12肌管細(xì)胞Akt T308的磷酸化，并伴有GLUT4質(zhì)膜轉(zhuǎn)移和細(xì)胞對(duì)2-DG攝取的提高，表明淫羊藿苷具有改善高糖誘導(dǎo)的C2C12肌管細(xì)胞胰島素抵抗的作用。

早期研究表明，淫羊藿苷可增加正常培養(yǎng)的C2C12肌管細(xì)胞的脂聯(lián)素(adiponectin)產(chǎn)量，促進(jìn)AMPK、IRS-1及PI3K的磷酸化，因而被認(rèn)為可能會(huì)影響胰島素信號(hào)的敏感性[10]。盡管AMPK在調(diào)節(jié)脂聯(lián)素生產(chǎn)和胰島素信號(hào)通路中具有重要作用，本研究未觀察到高糖對(duì)C2C12肌管細(xì)胞AMPK磷酸化的影響，也未觀察到淫羊藿苷對(duì)高糖作用下C2C12肌管細(xì)胞AMPK磷酸化的影響(資料未顯示)。有研究表明，與無葡萄糖對(duì)照組比較，葡萄糖具有降低AMPKα(Thr172)磷酸化水平的作用[11]。因此，AMPK在高糖誘導(dǎo)的C2C12肌管細(xì)胞胰島素抵抗中的作用有待進(jìn)一步研究。同時(shí)，本研究也證實(shí)淫羊藿苷減輕高糖誘導(dǎo)的C2C12肌管細(xì)胞胰島素抵抗的作用不依賴于AMPK。

p38 MAPK可控制骨骼肌細(xì)胞胰島素信號(hào)傳導(dǎo)、葡萄糖穩(wěn)態(tài)、脂肪酸代謝和能量消耗等，在骨骼肌代謝功能的調(diào)節(jié)中具有重要作用[12-13]。提高正常培養(yǎng)或胰島素抵抗下C2C12肌管細(xì)胞的p38 MAPK磷酸化或活性可改善細(xì)胞胰島素信號(hào),增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取[14-15]。與上述結(jié)果相一致，本研究結(jié)果表明，高糖可降低p38 MAPK磷酸化，且p38 MAPK磷酸化的降低與Akt T308磷酸化的降低、GLUT4質(zhì)膜轉(zhuǎn)位的降低及細(xì)胞對(duì)2-DG攝取的降低相一致，提示p38 MAPK是高糖誘導(dǎo)C2C12肌管細(xì)胞胰島素抵抗的關(guān)鍵因素。在本研究中，淫羊藿苷可恢復(fù)高糖作用下C2C12肌管細(xì)胞p38 MAPK磷酸化，抑制p38 MAPK活性和降低p38 MAPK蛋白表達(dá)均可顯著降低淫羊藿苷對(duì)Akt T308 磷酸化、GLUT4質(zhì)膜轉(zhuǎn)位及細(xì)胞對(duì)2-DG攝取的影響，提示淫羊藿苷通過提高p38 MAPK的磷酸化或活性而減輕高糖誘導(dǎo)的C2C12肌管細(xì)胞的胰島素抵抗。

總之，本研究的結(jié)果表明淫羊藿苷具有減輕C2C12細(xì)胞胰島素抵抗的作用，這為了解淫羊藿苷抗糖尿病的作用機(jī)制提供了參考資料。但對(duì)于淫羊藿苷是如何控制p38 MAPK磷酸化或活性的具體機(jī)制尚待深入研究。