楊濤瑋，汪幫琦，胡衛(wèi)列△

(1南方醫(yī)科大學(xué)，廣東 廣州 510515；2中國解放軍南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院泌尿外科，廣東 廣州510010)

腎上腺皮質(zhì)癌(adrenal cortical carcinoma，ACC)是一種起源于腎上腺皮質(zhì)的惡性腫瘤，每年發(fā)病率約為0.5～2.0/100萬人，該病起病隱匿，惡性程度高，侵襲力強(qiáng)，容易向肝臟、肺、后腹膜及淋巴轉(zhuǎn)移[1-3]。完全性手術(shù)切除是早期ACC治療的重要手段，但術(shù)后復(fù)發(fā)率高，即使完全切除腫瘤，患者5年生存率僅為30%。ACC缺乏有效的藥物治療，目前國內(nèi)外推薦最有效的藥物米托坦，其有效率僅為35%，且僅能短暫減緩腫瘤進(jìn)展速度[4]。

阿昔替尼(axitinib)為小分子多靶點(diǎn)酪氨酸激酶抑制劑，可靶向作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體(vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR)，具有抑制腫瘤血管生成和抗腫瘤細(xì)胞生長的作用[5-6]。目前臨床上阿昔替尼主要用于腎癌的治療，少有在ACC治療中應(yīng)用。本文研究阿昔替尼是否可抑制人腎上腺皮質(zhì)癌SW-13細(xì)胞的生長，并探究其作用機(jī)理，為阿昔替尼臨床用于ACC治療提供科學(xué)依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 細(xì)胞株

人腎上腺皮質(zhì)癌SW-13細(xì)胞購自上海中科院細(xì)胞庫。

2 主要試劑

阿昔替尼購自MedChemExpress；L-15培養(yǎng)基(杭州吉諾公司)；胎牛血清、胰蛋白酶、二甲基亞砜、青霉素和鏈霉素(Gibco)；CCK-8細(xì)胞活力檢測試劑盒和Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(Dojindo)；細(xì)胞周期檢測試劑盒(武漢碧云天公司)；兔抗人β-actin、兔抗人VEGFR 2、p-ERK 1/2和ERK1/2 抗體(Abcam)。

3 主要方法

3.1細(xì)胞培養(yǎng) 人腎上腺皮質(zhì)癌SW-13細(xì)胞用含有10%胎牛血清、1%青霉素和鏈霉素的L-15培養(yǎng)基、接種于25 cm2培養(yǎng)瓶，在37 ℃、無CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。待細(xì)胞密度處于70%～80%時進(jìn)行傳代；用對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。一般2 d換液，4 d細(xì)胞傳代。

3.2CCK-8法檢測細(xì)胞存活率 將對數(shù)生長期的SW-13細(xì)胞以2.5×107/L密度接種于96孔板中，每孔含培養(yǎng)液100 μL，設(shè)置5個藥物實(shí)驗(yàn)組(阿昔替尼濃度分別為0.1、1、2.5、5、10和20 μmol/L)、1個正常對照組和1個空白組，每組4個復(fù)孔。在受試物處理24 h、48 h和72 h后，每孔加入CCK-8試劑10 μL，避光反應(yīng)4 h，用酶標(biāo)儀檢測各孔在450 nm波長的吸光度(A)值，以空白對照孔調(diào)零，計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率(%)=(A實(shí)驗(yàn)組-A空白組)/(A正常對照組-A空白組)×100%。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

3.3流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期 將細(xì)胞接種傳代于6孔板中，每孔細(xì)胞接種約5×104個，待細(xì)胞鋪滿板底約60%時棄原培養(yǎng)基，PBS沖洗孔板2次，分組并更換含受試物的培養(yǎng)基，再培養(yǎng)細(xì)胞48 h。按細(xì)胞周期檢測試劑盒標(biāo)準(zhǔn)操作流程，消化收集并固定細(xì)胞，染色后上BD流式細(xì)胞儀檢測。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

3.4Annexin V/PI雙染法檢測SW-13細(xì)胞凋亡 取處于對數(shù)生長期SW-13細(xì)胞接種于6孔板(每孔5×104細(xì)胞)，待細(xì)胞鋪滿板底約60%時棄原培養(yǎng)基，PBS沖洗孔板2次，分別換相應(yīng)受試物培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞48 h。加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI染液，室溫下避光染色15min，上流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。

3.5劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力 將24孔板背面橫向畫線，每孔3條。對數(shù)生長期細(xì)胞消化并均勻接種于孔板內(nèi)，培養(yǎng)細(xì)胞密度為細(xì)胞間無空隙。用直尺比劃，以100 μL槍頭沿直尺固定，垂直于孔板背后畫線，對孔板細(xì)胞筆直劃痕。用PBS沿孔板邊輕沖洗細(xì)胞3次，吸去劃下的細(xì)胞，對照組加入無血清L-15培養(yǎng)基，藥物組分別加入無血清含有4、8和16 μmol/L藥物的培養(yǎng)基。放入上述培養(yǎng)條件培養(yǎng)，分別于18 h和36 h在相差顯微鏡下選定同一位置拍照，計(jì)算細(xì)胞遷移率。

3.6Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲能力 將對數(shù)生長期細(xì)胞撤血清饑餓培養(yǎng)過夜。消化細(xì)胞、離心，并分別用無血清培養(yǎng)基及含4、8和16 μmol/L阿昔替尼藥物的無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。調(diào)整細(xì)胞濃度至1×108/L。分別取細(xì)胞懸液200 μL加入Transwell小室，小室下孔板內(nèi)加入500 μL含30%FBS的培養(yǎng)基。細(xì)胞培養(yǎng)36 h后，棄去培養(yǎng)液，將Transwell小室取出，用棉簽擦去小室內(nèi)側(cè)細(xì)胞及基質(zhì)膠，無水甲醛固定小室外側(cè)細(xì)胞20 min，再用0.1%結(jié)晶紫溶液染色15min，PBS沖洗小室內(nèi)外側(cè)3次。在倒置相差顯微鏡，計(jì)數(shù)5個隨機(jī)視野的細(xì)胞數(shù)量。

3.7Western blot檢測相關(guān)蛋白表達(dá) 收集阿昔替尼處理48 h的SW-13細(xì)胞至離心管中，充分裂解細(xì)胞，利用考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白濃度，進(jìn)行12%SDS-PAGE分離，使用半干轉(zhuǎn)膜法將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上，脫脂乳室溫封閉1 h，加人 I 抗兔抗人β-actin抗體、兔抗人VEGFR2 抗體、兔抗人p-ERK 1/2抗體及兔抗人ERK1/2 抗體，置于4℃搖床過夜孵育。用TBST洗滌5次，每次5 min，加入II抗(HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG)，室溫孵育1h，ECL發(fā)光試劑顯色，利用化學(xué)發(fā)光型凝膠成像系統(tǒng)檢測目的條帶，內(nèi)參照采用β-actin，利用ImageJ軟件進(jìn)行灰度分析。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

各組實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，采用 SPSS 20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。細(xì)胞活力和劃痕愈合實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用兩因素方差分析(two-way ANOVA)，兩兩比較采用Bonferroni檢驗(yàn)；細(xì)胞周期、細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞凋亡率和Western blot結(jié)果分析采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，兩兩比較采用Tukey檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 CCK-8法檢測阿昔替尼對SW-13細(xì)胞生長的抑制作用

以0 μmol/L阿昔替尼作為對照組，結(jié)果顯示，同一時點(diǎn)，隨阿昔替尼濃度增加，細(xì)胞存活率明顯降低(P<0.05)；同一藥物濃度，隨作用時間延長，細(xì)胞存活率也顯著降低(P<0.01)，見圖1，即阿昔替尼抑制SW-13細(xì)胞增殖呈濃度-時間相關(guān)性。計(jì)算出阿昔替尼作用24 h、48 h和72 h的半數(shù)抑制濃度(IC50)分別為(19.06±1.09) μmol/L、(6.49±0.03) μmol/L和(4.13±0.04) μmol/L。

Figure 1.The effect of axitinib on the viablility of SW-13 cells. Mean±SD.n=4.*P<0.05,**P<0.01vs0 μmol/L group;##P<0.01vs24 h group.

圖1 阿昔替尼對SW-13細(xì)胞活力的影響

2 阿昔替尼阻滯SW-13細(xì)胞周期

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，與對照組相比，4 μmol/L和8 μmol/L阿昔替尼組S期無明顯變化，處于G0/G1期細(xì)胞的比例減少(P<0.01)，而G2/M細(xì)胞的比例明顯升高(P<0.01)，見圖2。表明阿昔替尼對細(xì)胞周期有抑制作用，可將SW-13阻滯在G2/M期。

3 阿昔替尼促進(jìn)SW-13細(xì)胞凋亡

Annexin V/PI雙染色流式細(xì)胞檢測結(jié)果顯示，對照組細(xì)胞凋亡率為(3.50±0.42)%，1 μmol/L、4 μmol/L和8 μmol/L阿昔替尼組細(xì)胞凋亡率分別為(3.80±0.60)%、(9.80±1.08)%和(17.90±2.17)%。與對照組比較，4 μmol/L和8 μmol/L阿昔替尼組細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.01)，見圖3。

4 阿昔替尼減弱SW-13細(xì)胞遷移能力

對照組在18 h和36 h后，細(xì)胞已明顯向劃痕區(qū)遷移并覆蓋劃痕空白條帶，而阿昔替尼干預(yù)后，能夠顯著抑制 SW-13細(xì)胞向劃痕區(qū)的遷移。Two-way ANOVA分析，除4 μmol/L組在18 h遷移率與對照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性外，其余各阿昔替尼組遷移率和對照組相比均顯著降低(P<0.01)，見圖4。提示阿昔替尼可減弱SW-13細(xì)胞遷移能力，且阿昔替尼抑制細(xì)胞弱遷移的能力和其作用時間和藥物濃度呈正比關(guān)系。

Figure 2.The effect of axitinib on the cell cycle distribution of SW-13 cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group.

圖2 阿昔替尼對SW-13細(xì)胞周期的影響

Figure 3.Axitinib induced apoptosis in the SW-13 cells. The SW-13 cells treated with Axitinib were stained with annexin V-PI and subjected to flow cytometry analysis. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group.

圖3 阿昔替尼對SW-13細(xì)胞凋亡的影響

Figure 4. The effect of axitinib on migration ability of SW-13 cells (×200). Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group.

圖4 劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測阿昔替尼對細(xì)胞遷移能力的影響

5 阿昔替尼抑制SW-13細(xì)胞侵襲能力

Transwell小室外側(cè)的SW-13細(xì)胞數(shù)量，8和16 μmol/L阿昔替尼組較對照組明顯減少(P<0.01)，見圖5。結(jié)果表明阿昔替尼可以抑制SW-13細(xì)胞對組織基質(zhì)的侵襲能力。

6 阿昔替尼抑制VEGFR2介導(dǎo)的ERK1/2磷酸化

Western blot結(jié)果示,與對照組相比，阿昔替尼呈劑量依賴性地抑制VEGFR2的表達(dá)；p-ERK1/2在用藥后的蛋白水平明顯降低(P<0.01)，而ERK1/2的表達(dá)無明顯差異,見圖6。提示阿昔替尼抑制前列腺癌細(xì)胞的活力和遷移可能與調(diào)控VEGFR2和ERK1/2磷酸化水平相關(guān)。

Figure 5.The effect of axitinib on the invasion ability of SW-13 cells(×100). Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group.

圖5 阿昔替尼對細(xì)胞侵襲能力的影響

Figure 6.The effects of axitinib on the protein levels of VEGFR2 and p-ERK1/2 in SW-13 cells was determined by Western blot. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group.

圖6 阿昔替尼對SW-13細(xì)胞VEGFR2和p-ERK1/2蛋白表達(dá)水平的影響

討 論

腎上腺皮質(zhì)癌是原發(fā)于腎上腺皮質(zhì)的惡性腫瘤。據(jù)研究報(bào)道ACC年發(fā)病率為0.02%[1-3]。ACC起病隱匿，腎上腺皮質(zhì)癌組織形態(tài)在影像學(xué)上和正常腎上腺組織相似，影像學(xué)診斷困難。有功能ACC腫瘤其臨床表現(xiàn)與腎上腺良性腫瘤表現(xiàn)相似，容易誤診漏診；而無功能型ACC更難以被發(fā)覺；多數(shù)ACC患者被診斷時已有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。失去手術(shù)機(jī)會的ACC患者，需要使用化療、放療、腫瘤栓塞等姑息治療方法，然而這些治療效果都不理想。即使是早期ACC患者施行根治性切除術(shù)，也需要術(shù)后服用藥物來防止腫瘤復(fù)發(fā)[7]。

米托坦作為FDA唯一批準(zhǔn)使用的ACC治療藥物，其有效率僅為35%[4]，且米托坦并不能使ACC患者遠(yuǎn)期生存率顯著提高。尋找耐受好、療效佳的治療ACC的藥物已成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)。近年來酪氨酸酶抑制劑相關(guān)靶向藥物，如VEGFR抑制劑等，成為了抗腫瘤靶點(diǎn)研究熱點(diǎn)，但VEGFR是否也可能是ACC理想的治療靶點(diǎn)，目前文獻(xiàn)很少。阿昔替尼作為多靶點(diǎn)酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitor，TKI)，其主要作用的受體為VEGFR、PDGFR和c-KIT，可通過酪氨酸激酶受體抑制作用，阻斷受體型酪氨酸激酶相關(guān)信號通路，使腫瘤細(xì)胞失去繼續(xù)分裂和生長的能力[5-6]。Kroiss等[8]在157例腎上腺皮質(zhì)癌和9例正常腎上腺組織樣品中利用免疫組織化學(xué)檢測了VEGF和VEGFR的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，VEGFR2在ACC組織中表達(dá)量較正常腎上腺組織顯著增高，同時發(fā)現(xiàn)舒尼替尼可以抑制ACC細(xì)胞系的增殖，并通過下調(diào)HSD3B2表達(dá)來抑制腎上腺皮質(zhì)癌細(xì)胞皮質(zhì)醇的分泌。文獻(xiàn)報(bào)道索拉菲尼(sorafenib)，另一種TKI，可通過有效抑制VEGFR1、VEGFR2和PDGFR，顯著抑制腎上腺皮質(zhì)癌細(xì)胞的生長，表明其在腎上腺皮質(zhì)癌細(xì)胞中具有抗血管生成和抗腫瘤作用[9]，以上研究表明酪氨酸酶抑制劑類可能通過抑制VEGFR，繼而抑制腫瘤增殖及血管生成，達(dá)到治療ACC的目的。本研究中，我們通過CCK-8法來檢測阿昔替尼對SW-13細(xì)胞活力的抑制作用。結(jié)果表明，隨著藥物濃度的升高或藥物作用時間的增長，SW-13細(xì)胞存活率降低，藥物抑制SW-13細(xì)胞活力呈濃度和時間雙重依賴性。值得注意到的是，阿昔替尼24 h的半抑制濃度(IC50)為19.06 μmol/L，在24 h～48 h期間IC50有顯著下降，而48 h和72 h的IC50較為穩(wěn)定，分別為6.491μmol/L和4.125μmol/L，推測可能由于24 h時細(xì)胞尚處于第一個分裂周期，此后細(xì)胞分裂受到抑制，故48 h后的IC50變小，即很低濃度的藥物即可抑制細(xì)胞的活力?？梢酝茰y，阿昔替尼對腫瘤細(xì)胞的作用主要是通過抑制其生長，而可能并不主要是通過殺傷細(xì)胞導(dǎo)致的。以上推測在分析細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)中得到了進(jìn)一步的證實(shí)。本研究中流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，阿昔替尼可劑量依賴地將SW-13細(xì)胞阻滯于G2/M期，使得細(xì)胞不能進(jìn)入M期，導(dǎo)致分裂指數(shù)下降，細(xì)胞增殖被抑制；而G2/M期阻滯可能也是DNA的修復(fù)期，損傷的DNA在染色體分離前可能得到修復(fù)，而不能修復(fù)者則退出增殖周期，進(jìn)入凋亡途徑[10]。本研究結(jié)果，阿昔替尼用藥48 h后，SW-13細(xì)胞的凋亡率明顯升高，也證明了這一點(diǎn)。但其促凋亡作用似沒有周期阻滯作用明顯，是否阿昔替尼在抑制SW-13細(xì)胞活力的過程中，相對促進(jìn)其細(xì)胞凋亡而言，藥物對細(xì)胞周期生長的阻滯更加重要，還尚需進(jìn)一步證明。

惡性腫瘤除了增殖、細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡等基本生長繁殖特征外，其生物學(xué)特征還包括轉(zhuǎn)移特性。本研究劃痕愈合實(shí)驗(yàn)顯示，阿昔替尼可減弱SW-13細(xì)胞遷移能力，并且隨作用時間延長或藥物濃度增高，減弱遷移能力的效果越明顯。Transwell實(shí)驗(yàn)也證實(shí)阿昔替尼抑制了SW-13細(xì)胞的侵襲能力。這兩個實(shí)驗(yàn)互相佐證，證明了阿昔替尼可以降低SW-13細(xì)胞的遷移、侵襲能力，這是抗腫瘤轉(zhuǎn)移的重要藥物特征。

如前所述，酪氨酸激酶抑制劑是ACC治療的潛在重要靶點(diǎn)。其中VEGFR相關(guān)通路可能通過影響腫瘤增殖、血管生成等達(dá)到治療腫瘤的目的。VEGF配體通過結(jié)合到VEGFR2上，催化ATP上的磷酸基轉(zhuǎn)移到Ras蛋白酪氨酸殘基上，激活Ras，然后進(jìn)一步激活PARK級聯(lián)反應(yīng)：Raf1→MEK1/2→ERK1/2[11]。MAPK/ERK信號通路，不僅在細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、遷移等過程中起到重要作用，也處于血管生成信號通路的調(diào)節(jié)中心，決定腫瘤血管生成的最終狀態(tài)[12]。ERK分為ERK1和ERK2，主要通過磷酸化而激活為有活性的p-ERK1/2，參與腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和血管形成過程，并在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移過程中起重要作用。Sun等[12]研究表明，一種抗血管生成化合物EPOX可以通過抑制ERK磷酸化，從而具有抗腫瘤血管形成的作用。本實(shí)驗(yàn)Western blot結(jié)果顯示，阿昔替尼減少了VEGFR2和p-ERK1/2的蛋白水平。可以推測，阿昔替尼下調(diào)VEGFR2表達(dá)，導(dǎo)致級聯(lián)反應(yīng)Raf1→MEK1/2→ERK1/2抑制，從而抑制ERK的磷酸化這一機(jī)制可能與阿昔替尼體外抑制SW-13細(xì)胞活力有關(guān)。