梁 瑩，李劍波，邵欣寧，林 柳，雷 鳴△

(1廣州市第八人民醫(yī)院腎內(nèi)科，廣東 廣州 510060;2中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院腎內(nèi)科，廣東 廣州 510080)

侵襲和轉(zhuǎn)移是影響腎癌患者整體預(yù)后的重要因素。盡管目前腎癌包括手術(shù)、放化療在內(nèi)的治療方式和效果長足進展，但腎癌患者的總體預(yù)后并不能令人滿意。超過30%的腎癌患者會發(fā)生轉(zhuǎn)移[1]。侵襲轉(zhuǎn)移也是導(dǎo)致腎癌進展、復(fù)發(fā)和致死的主要原因，嚴(yán)重影響患者的療效和生存質(zhì)量。因此，深入研究腎癌轉(zhuǎn)移的發(fā)生機制，尋找可以有效干預(yù)腎癌轉(zhuǎn)移的分子靶點，是提高腎癌患者療效和改善其預(yù)后的有效途徑[2-3]。學(xué)術(shù)界普遍認為，上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)過程在腎癌等惡性腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移中具有重要作用，因此探尋其中與腎癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的分子，有助于豐富對于腎癌轉(zhuǎn)移機制的認識，開發(fā)針對腎癌EMT的有效治療靶點，對實現(xiàn)抑制腎癌的侵襲轉(zhuǎn)移具有科學(xué)意義[4]。近年來研究表明，微小RNA(microRNA, miR)-145與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系，可能通過多種分子生物途徑發(fā)揮抑癌作用有望成為腎癌的基因治療靶點[5]。然而，在對腎癌進行miR-145靶向基因治療后，對腎癌細胞上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化和侵襲轉(zhuǎn)移的影響及其機制尚不明確[6]。本研究對miR-145的靶基因進行生物信息學(xué)預(yù)測后提示，與多種惡性腫瘤生物學(xué)行為相關(guān)的解整聯(lián)蛋白-金屬蛋白酶28(a disintegrin and metalloproteinase 28，ADAM28)可能是其在細胞中的作用靶蛋白[7]。本項工作采用miR-145模擬物(miR-145 mimics)轉(zhuǎn)染人腎癌細胞系A(chǔ)-498細胞，觀察其對腎癌細胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程的影響，進而通過研究其對EMT相關(guān)功能蛋白及ADAM28蛋白表達水平的影響，進一步明確其分子生物學(xué)機制。

材 料 和 方 法

1 材料

miR-145 mimics及其陰性對照(mimic negative control, MNC)、miR-145 及內(nèi)參照RNU6的PCR引物、雙螢光素酶檢驗試劑盒、野生型的WT-ADAM28 psiCHECKTM-2載體及3’UTR定點突變后的MT-ADAM28 psiCHECKTM-2載體和3’UTR定點突變的ADAM28過表達質(zhì)粒載體購自廣州愛科生物技術(shù)有限公司。DMEM高糖培養(yǎng)液和胎牛血清購自GIBCO;轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體2000購自Invitrogen; Transwell小室購自NUNC; real-time PCR和逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)試劑盒購自TaKaRa。兔抗人ADAM28、兔抗人波形蛋白(vimentin)、兔抗人E-鈣黏蛋白(cadherin)和兔抗人β-肌動蛋白(actin)抗體購自Abcam。腎癌細胞株A-498購自美國模式培養(yǎng)物集存庫(ATCC? Number: HTB-44TM)。

2 方法

2.1miRNA轉(zhuǎn)染和RT-qPCR檢測 以含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)A-498腎癌細胞株。按照轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體2000試劑說明書，在細胞融合度約60%時以miRNA mimics終濃度為65 nmol/L轉(zhuǎn)染miR-145 mimics和MNC，分別作為M145和MNC組轉(zhuǎn)染48 h;以未轉(zhuǎn)染A-498細胞作為空白對照(mock control, MC)組。TRIzol法提取各組細胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以U6 snRNA為內(nèi)參照，進行RT-qPCR檢測。miR-145的正向引物序列為 5’-ACACTCCAGCTCCATGGGGGTTTTCCCAGGA-3’，反向引物序列為5’-CTCAACTGAGTCGGTGGGCAGTTGAGAGGGATTC-3’；U6的正向引物序列為5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，反向引物序列為5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。PCR條件為： 92 ℃ 35 s; 92 ℃ 5 s, 57 ℃ 38 s, 52個循環(huán)。循環(huán)延伸末端收集熒光信號，所得數(shù)據(jù)用2-ΔΔCt法進行分析計算。

2.2Transwell法檢測細胞侵襲能力 將Matrigel稀釋后，每個Transwell小室加入45 μL，37 ℃凝固2 h。分組轉(zhuǎn)染后，各組細胞分別取對數(shù)期0.8×105個細胞160 μL無血清培養(yǎng)液重懸后加入Transwell小室上室。Transwell下室加入500 μL含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液。細胞培養(yǎng)箱37 ℃常規(guī)培養(yǎng)48 h，清除上室底膜未穿膜上室細胞，甲醇固定穿膜上室細胞20 min，PBS沖洗。1%結(jié)晶紫染色30 min，PBS沖洗。顯微鏡下觀察上室底膜，計數(shù)穿過小孔細胞[8]。

2.3miR-145靶基因預(yù)測 運用生物信息學(xué)方法明確miRBase數(shù)據(jù)庫中搜索hsa-miR-145基因的序列, 進而分析miR-145序列的特征并預(yù)測其靶基因。

2.4Western blot法檢測細胞蛋白表達的變化 腎癌細胞分組轉(zhuǎn)染后48 h，按照既往報道方法收集細胞，提取總蛋白，進行Western blot檢測，分析ADAM28、波形蛋白、E-鈣黏蛋白和內(nèi)參照β-actin蛋白的表達[8]。

2.5ADAM28過表達對miR-145抑制EMT的拮抗作用 采用ADAM28過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染M145組細胞系，并通過Western blot檢測ADAM28過表達后M145組A-498細胞中ADAM28和EMT相關(guān)蛋白的表達情況。

2.6雙螢光素酶報告基因?qū)嶒灆z測miR-145與ADAM28的關(guān)系 采用野生型的ADAM28 psiCHECKTM-2載體及定點突變后的ADAM28 psiCHECKTM-2載體，分別和miR-145 mimics一起通過脂質(zhì)體共轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染48 h后檢測螢光素酶相對活性。

3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 13.0軟件進行分析。實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。多組間比較用單因素方差分析(one-way ANOVA)，兩組之間比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 miR-145 mimics轉(zhuǎn)染對A-498細胞miR-145水平的影響

轉(zhuǎn)染A-498細胞48 h后，RT-qPCR檢測各組細胞中miR-145的表達水平。結(jié)果顯示，與MC組相比，M145組miR-145的表達水平顯著上調(diào)(P<0.05)，而MNC組的miR-145表達水平與MC組差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖1。

Figure 1.RT-qPCR was used to detect the expression of miR-145 in renal carcinoma A-498 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsMC group.

圖1 RT-qPCR檢測各組A-498腎癌細胞中miR-145的表達水平

2 miR-145對A-498細胞侵襲能力的影響

Transwell實驗中，經(jīng)過48 h培養(yǎng)，觀察受到染色的穿膜細胞數(shù)量。結(jié)果顯示，M145組侵襲細胞數(shù)量顯著低于MC組(P<0.05)，而MNC組的細胞數(shù)量與MC組之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖2。

3 miR-145對A-498細胞EMT相關(guān)功能蛋白表達的影響

Figure 2.The invasion ability of A-498 cells in each group was detected by Transwell assay. The scale bar=50 μm. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsMC group.

圖2 Transwell實驗比較各組A-498細胞侵襲能力

Western blot實驗顯示，與MC組相比，M145組vimentin蛋白表達量顯著降低(P<0.05)，E-cadherin蛋白表達量顯著升高(P<0.05)，而MNC組與對照組之間的蛋白表達無顯著差異(P>0.05),見圖3。

Figure 3.Western blot assay was used to detect the expression level of EMT-related proteins in A-498 cells of each group. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsMC group.

圖3 Western blot實驗檢測各組A-498細胞EMT相關(guān)蛋白表達水平

4 miR-145靶基因的預(yù)測

miRBase生物信息學(xué)預(yù)測結(jié)果表明，miR-145與ADAM28的3’-UTR部分互補，ADAM28可能是miR-145的靶基因,見圖4。

Figure 4.Bioinformatic prediction results of miR-145 target genes from bioinformatics prediction.

圖4 miR-145靶基因生物信息學(xué)預(yù)測結(jié)果

5 miR-145對A-498細胞ADAM28蛋白表達的影響

Western blot實驗顯示，與MC組相比，M145組ADAM28蛋白表達量顯著降低(P<0.05)，ADAM28蛋白表達量的Western blot結(jié)果與miR-145的表達水平表現(xiàn)出負相關(guān)關(guān)系。而MNC組與MC組之間的ADAM28蛋白表達無顯著差異(P>0.05)，見圖5。

Figure 5.Western blot assay was used to detect the expression level of ADAM28 protein in A-498 cells of each group. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsMC group.

圖5 Western blot實驗檢測各組A-498細胞ADAM28蛋白表達水平

6 ADAM28過表達對miR-145抑制腎癌細胞EMT的拮抗效果

Western blot實驗檢測到，相比單純miR-145 mimic轉(zhuǎn)染組細胞，采用ADAM28過表達質(zhì)粒聯(lián)合轉(zhuǎn)染后的M145組細胞ADAM28表達量升高(P<0.05)，同時，細胞中vimentin蛋白表達量顯著升高(P<0.05)，E-cadherin蛋白表達量顯著降低(P<0.05)，見圖6。

Figure 6. The effect of miR-145 on the expression of EMT-rela-ted proteins in A-498 cells with or without ADAM28 over-expression. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsM145 group.

圖6 ADAM28過表達拮抗miR-145對A-498細胞EMT相關(guān)功能蛋白表達的影響

7 miR-145與ADAM28相互作用關(guān)系的雙螢光素酶報告基因?qū)嶒灆z測

雙螢光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果顯示miR-145能顯著抑制野生型WT-ADAM28 psiCHECKTM-2載體的發(fā)光強度(P<0.05)，而無法抑制3’UTR定點突變型MT-ADAM28 psiCHECKTM-2載體的發(fā)光強度(P>0.05)，見圖7，說明ADAM28為miR-145的下游靶基因。

Figure 7.The relative luciferase activity of ADAM28. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsMC group.

圖7 ADAM28的螢光素酶活性比較

討 論

miR-145的基因定位于染色體5q32，與miR-143組成一個轉(zhuǎn)錄單位，生成同一個前體，經(jīng)過內(nèi)切酶剪切后形成[9]。miR-145在人體內(nèi)子宮、卵巢、睪丸、前列腺、脾臟和心臟等組織器官中高表達，而在宮頸癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、肝癌、膀胱癌、卵巢癌和腦垂體瘤等低表達[10]。所以，miR-145有可能在腎癌發(fā)生、發(fā)展中扮演抑癌基因的作用[6]。本研究嘗試采用miR-145 mimics實現(xiàn)對人腎癌細胞A-498中miR-145的過表達，進而檢測到對腎癌細胞侵襲能力的抑制，說明miR-145高表達具有對人腎癌細胞A-498侵襲能力的抑制效果。

既往研究表明，miR-145與多種惡性腫瘤的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程密切相關(guān)。EMT在腫瘤遷移和侵襲的發(fā)生這一多因素多步驟的動態(tài)過程中起重要作用，是腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的重要分子生物學(xué)機制[11]。EMT是胚胎發(fā)育及腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中，上皮細胞通過特定程序轉(zhuǎn)化為具有間質(zhì)表型細胞的生物學(xué)過程，主要表現(xiàn)為細胞黏附分子(如上皮標(biāo)志物E-cadherin)表達減少及間充質(zhì)標(biāo)志物(如vimentin)表達增多等。為明確miR-145抑制腎癌細胞遷移能力和侵襲能力是否是通過對A-498細胞的EMT調(diào)控實現(xiàn)的，本研究對EMT相關(guān)功能蛋白進行了檢測，結(jié)果表明，miR-145過表達后，vimentin蛋白表達量顯著降低，E-cadherin蛋白表達量顯著升高，提示miR-145實現(xiàn)了對EMT過程的抑制，進而進行了對腎癌細胞遷移能力和侵襲能力的抑制。

MicroRNA的主要作用機制是與靶蛋白mRNA的3’-UTR形成互補配對，進而使其降解，抑制靶蛋白的表達。對靶基因正確進行準(zhǔn)確的預(yù)測與鑒定，是研究microRNA生物學(xué)功能的基礎(chǔ)和關(guān)鍵。對目的microRNA進行生物信息學(xué)分析，能夠迅速預(yù)測出可能的靶基因作用位點，但是根據(jù)不同原則尋找靶基因，均可能出現(xiàn)假陽性和假陰性的預(yù)測結(jié)果。所以生物信息學(xué)軟件預(yù)測靶基因后，可以進一步采用生物學(xué)實驗方法進行驗證，以進一步研究其生物學(xué)功能[12]。本研究的生物信息學(xué)預(yù)測結(jié)果提示，ADAM28為miR-145的潛在靶基因，且其熱穩(wěn)定型和基因保守性較高。然而，單純從miR-145和下游靶基因基因序列上的相互作用預(yù)測模型的數(shù)據(jù)庫中并不能確切推斷其具體的生物學(xué)功能，及具體起效的靶蛋白。所以，在預(yù)測靶蛋白之后，必須對miR-145和靶基因的調(diào)控機制進行基因表達層面和功能調(diào)控層面的驗證。如果能夠通過生物學(xué)實驗證實兩者的直接調(diào)節(jié)關(guān)系，將有助深入了解miR-145在腎癌細胞的增殖、分化和凋亡以及與腎癌的發(fā)生、發(fā)展機制。ADAM28是ADAM家族的重要成員之一，由多個結(jié)構(gòu)域組成，包括前肽、金屬蛋白酶、表皮生長因子樣結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和細胞質(zhì)尾結(jié)構(gòu)域等。與其它ADAM相比，ADAM28是通過在細胞表面形成成熟的跨膜結(jié)構(gòu)域后，通過特異性自催化過程激活的[13]。報道顯示，ADAM28參與包括肺癌、乳腺癌、膀胱癌和白血病在內(nèi)的很多惡性腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移，在惡性腫瘤細胞中，對其進行靶向治療可能具有重要臨床意義[7，13]。本研究觀察到，對miR-145作用于腎癌細胞后，抑制ADAM28蛋白表達的效果顯著，細胞中的ADAM28蛋白表達水平顯著降低，這個結(jié)果促使我們對ADAM28是否是miR-145的靶蛋白進行進一步的深入探索。

我們構(gòu)建了3’-UTR突變的ADAM28過表達質(zhì)粒，使其轉(zhuǎn)染高表達miR-145的A-498細胞。伴隨ADAM28表達量的升高，細胞中vimentin蛋白表達量顯著升高，E-cadherin蛋白表達量顯著降低，說明3’-UTR突變后引起的ADAM28過表達可以實現(xiàn)對miR-145抑制EMT的拮抗作用。我們進而通過雙螢光素酶檢驗結(jié)果對兩者的直接相關(guān)關(guān)系進行探索，觀察到miR-145只能抑制野生型WT-ADAM28 psiCHECKTM-2載體的發(fā)光強度，而無法抑制3’UTR定點突變后的MT-ADAM28-psiCHECKTM-2載體的發(fā)光強度，說明ADAM28為miR-145直接的下游靶基因。

綜上所述，miR-145可能通過降低下游靶基因ADAM28水平影響EMT相關(guān)蛋白表達，進而抑制人腎癌細胞A-498的EMT功能，有可能成為腎癌基因治療的良好靶點。