辛?xí)云?，王家迎，張愛玲，鐘玉宜，何穎婷，陳贊謀，張哲，張豪，李加琪，袁曉龍

（1廣東省農(nóng)業(yè)動物基因組學(xué)與分子育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/國家生豬種業(yè)工程技術(shù)研究中心/華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，廣州 510642；2廣東高校應(yīng)用生態(tài)工程技術(shù)開發(fā)中心/廣東第二師范學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，廣州 510310）

0 引言

【研究意義】Kiss1基因位于人類1號染色體1q32—41區(qū)[1］，最早是在1996年由LEE等發(fā)現(xiàn)并命名[2］。目前，關(guān)于Kiss1基因的研究主要集中在哺乳動物中樞和神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的調(diào)節(jié)上[3］。有研究表明，Kiss1基因可以促進(jìn)卵巢卵泡的發(fā)育和排卵[4］，在卵泡生長發(fā)育的過程中扮演著重要角色[5］，例如，在成年發(fā)情期的大鼠中，抑制 kisspeptin的表達(dá)導(dǎo)致卵巢卵泡的發(fā)育異常[6-7］。除此之外，外源性的kisspeptin可以影響小鼠卵巢卵泡的正常發(fā)育與排卵[6-7］。豬的Kiss1基因位于9號染色體上[8］，包含2個外顯子，蛋白質(zhì)編碼區(qū)長度為417 bp（含終止子），編碼138個氨基酸[9］，編碼的多肽類激素是kisspeptin，經(jīng)剪切后生成含有54個氨基酸的kisspeptin-54多肽，kisspeptin-54在體內(nèi)可被分解為 kisspeptin-10，kisspeptin-13，kisspeptin-14，它們可以特異性結(jié)合在 G蛋白偶聯(lián)受體 54（G Protein-Coupled Receptors 54，GPR54）上[10］。本研究以豬卵巢顆粒細(xì)胞為模型，通過構(gòu)建p53和CEBPα的超表達(dá)載體和小干擾RNA，在mRNA和蛋白水平探索p53、CEBPα與Kiss1之間的表達(dá)調(diào)控關(guān)系，為探索Kiss1基因在卵巢顆粒細(xì)胞中的功能提供一定的理論基礎(chǔ)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】2008年，臧猛等克隆出了豬Kiss1基因全長，發(fā)現(xiàn)Kiss1基因在下丘腦、卵巢、垂體、心、肝等組織中都有不同水平的表達(dá)[9］。在小梅山豬卵巢組織中，劉萍等人發(fā)現(xiàn) Kiss1基因主要分布于各級卵泡顆粒細(xì)胞和卵泡膜細(xì)胞上[11］，同時，在人類、狨猴和大鼠的卵巢和顆粒細(xì)胞中都有檢測到kisspeptin的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，Kiss1基因突變可以導(dǎo)致人類、大鼠和小鼠的卵泡數(shù)量減少，阻礙卵巢卵泡的生長發(fā)育[12-14］。這些結(jié)果表明，Kiss1基因影響著卵泡的生長發(fā)育。但是，目前Kiss1基因在豬卵泡中的表達(dá)調(diào)控機(jī)制仍不清楚?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，Kiss1的上游區(qū)域存在p53和CEBPα的潛在結(jié)合位點(diǎn)，但是在豬卵巢顆粒細(xì)胞中，有關(guān)Kiss1、p53和CEBPα之間的表達(dá)調(diào)控關(guān)系尚不清楚?！緮M解決的關(guān)鍵問題】研究轉(zhuǎn)錄因子p53和CEBPα在豬卵巢顆粒細(xì)胞中對Kiss1基因之間的表達(dá)調(diào)控作用。

1 材料與方法

本研究所有試驗(yàn)工作于2016年6月至2017年6月在廣東省農(nóng)業(yè)動物基因組學(xué)與分子育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成。

1.1 試驗(yàn)材料

動物組織與細(xì)胞：用于基因克隆的 DNA樣品來源于中山白石豬場的長大二元雜母豬卵巢組織；豬卵巢顆粒細(xì)胞是取自廣州嘉禾望崗?fù)涝讏瞿肛i卵巢組織的原代細(xì)胞。

主要試劑：DNA提取試劑盒購自O(shè)MEGA公司；總RNA提取試劑Trizol、PrimeScript?1st Strand cDNA Synthesis Kit、DL2000、DL500均購自 TaKaRa公司；Taq酶購自南京諾唯贊生物科技有限公司；Lipofectamine? 3000、Opti-MEM? 購自Invitrogen公司；凝膠回收試劑盒、普通質(zhì)粒小提試劑盒、無內(nèi)毒素質(zhì)粒小提試劑盒購自廣州欣研（美技）生物科技有限公司；胰蛋白酶、DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基、PBS緩沖液、胎牛血清、青鏈霉素（雙抗）購自Hyclone公司；其他均為常規(guī)化學(xué)試劑。

1.2 母豬Kiss1基因上游區(qū)域潛在轉(zhuǎn)錄因子的預(yù)測

根據(jù)NCBI公布Kiss1基因的序列信息，參考基因轉(zhuǎn)錄起始上游850 bp到下游221 bp序列，通過以下4個在線軟件預(yù)測其潛在轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，并取交集作為預(yù)測結(jié)果：

TFBIND：http://tfbind.hgc.jp/

Biobase：http://www.gene-regulation.com/pub/programs/alibaba2/index.html

Jaspar：http://jaspar.genereg.net/

Research：http://alggen.lsi.upc.es/cgi-bin/promo_v3/promo/promoinit.cgi?dirDB=TF_8.3

1.3 豬p53和CEBPα真核表達(dá)載體的構(gòu)建

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫轉(zhuǎn)錄因子p53和CEBPα的基因序列信息，以豬卵巢顆粒細(xì)胞mRNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，分別以CDS-p53和CDS-CEBPα引物（表1）克隆其CDS區(qū)序列，長度分別為1 161 bp和1 227 bp，測序驗(yàn)證后連接到真核表達(dá)載體pcDNA3.1（+）上，分別命名為pcDNA3.1-p53和pcDNA3.1-CEBPα，用于轉(zhuǎn)染顆粒細(xì)胞，酶切鑒定結(jié)果如圖1。抽提無內(nèi)毒素質(zhì)粒，-20℃保存，用于下一步試驗(yàn)。PCR程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸 2.5 min，35個循環(huán)；72℃后延伸 10 min。

圖1 p53和CEBPα真核表達(dá)載體的酶切鑒定Fig. 1 Identified the eukaryotic expression vector of p53 and CEBPα

1.4 豬卵巢顆粒細(xì)胞的分離與培養(yǎng)

參考文獻(xiàn)[15］的方法分離與培養(yǎng)豬卵巢顆粒，主要步驟為：將屠宰場采集的母豬卵巢組織放入37℃的加入雙抗的PBS中，用注射器快速吸取卵巢顆粒細(xì)胞；用預(yù)熱的PBS重懸細(xì)胞，洗滌兩次，轉(zhuǎn)移到75 cm2的細(xì)胞培養(yǎng)瓶，放入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；48 h之后，換液，繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞長至90%以上時，用胰酶消化，轉(zhuǎn)移至24孔板、12孔板或6孔板，培養(yǎng)待用。

1.5 轉(zhuǎn)錄因子p53和CEBPα對Kiss1基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的影響

培養(yǎng)豬的卵巢顆粒細(xì)胞，24孔板分別轉(zhuǎn)染 50、100、200和500 ng的pcDNA3.1空載和pcDNA3.1-p53，通過qRT-PCR確定p53的超表達(dá)效果。24孔板分別轉(zhuǎn)染200 ng的pcDNA3.1-p53和pcDNA3.1至豬的卵巢顆粒細(xì)胞，qRT-PCR檢測超表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子p53后Kiss1基因的mRNA表達(dá)水平變化。6孔板分別轉(zhuǎn)染200 ng的pcDNA3.1-p53和pcDNA3.1至豬的卵巢顆粒細(xì)胞，Western Blot檢測轉(zhuǎn)錄因子p53對Kiss1基因蛋白表達(dá)水平的影響。

根據(jù)GenBank上豬p53已知序列，按siRNA序列設(shè)計(jì)原則，結(jié)合Ambion公司提供的網(wǎng)上在線設(shè)計(jì)工具，設(shè)計(jì)p53的siRNA引物，將siRNA序列進(jìn)行BLAST比對，以確定和其它基因沒有同源性。該siRNA由廣州銳博公司合成，引物序列見表 1中p53-siRNA引物。培養(yǎng)豬的卵巢顆粒細(xì)胞，24孔板分別轉(zhuǎn)染 50 nmol·L-1的 Scrambled 和 p53-siRNA，qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)錄因子p53的干擾效果。24孔板分別轉(zhuǎn)染 50 nmol·L-1的 Scrambled 和 50 nmol·L-1的p53-siRNA至豬的卵巢顆粒細(xì)胞，qRT-PCR檢測干擾p53后Kiss1基因的mRNA水平變化。6孔板分別轉(zhuǎn)染 50 nmol·L-1的 Scrambled 和 50 nmol·L-1的p53-siRNA至豬的卵巢顆粒細(xì)胞，Western Blot檢測干擾轉(zhuǎn)錄因子p53后對Kiss1基因蛋白表達(dá)水平的影響。

轉(zhuǎn)錄因子CEBPα的操作同轉(zhuǎn)錄因子p53。

1.6 ChIP檢測p53和CEBPα在Kiss1基因上游區(qū)域的結(jié)合情況

使用轉(zhuǎn)錄因子p53和CEBPα的特異性抗體，通過染色質(zhì)免疫共沉淀方式富集DNA；在潛在轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)附近設(shè)計(jì)引物，產(chǎn)物范圍為100—160 bp，引物序列見表1（ChIP-kiss1-p53和ChIP-kiss1-CEBPα）以富集的 DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增；具體操作為：在細(xì)胞培養(yǎng)瓶里加入37%甲醛使甲醛終濃度為1%，加10×甘氨酸中和未反應(yīng)的甲醛，用預(yù)冷的PBS洗滌兩遍，經(jīng)超聲裂解，染色體免疫沉淀，反向交聯(lián)和 DNA純化，定性PCR，PCR反應(yīng)條件為：95℃ 3 s，然后 95℃ 10 s，60℃ 30 s，72℃，1 min，共40個循環(huán)，72℃ 5 min。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.7 瞬時轉(zhuǎn)染

當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)細(xì)胞密度為80%—90%時進(jìn)行換液，換無雙抗的培養(yǎng)基，隨后進(jìn)行瞬時轉(zhuǎn)染，具體操作按照 Invitrogen公司提供的 Lipofectamine? 3000 Reagents說明書進(jìn)行，轉(zhuǎn)染6—8 h時更換有雙抗的培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染48 h后進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

1.8 qRT-PCR和Western Blot檢測p53和CEBPα對Kiss1表達(dá)水平的影響

參照Invitrogen TRIzol操作說明書，提取母豬卵巢顆粒細(xì)胞的總RNA；總RNA的反轉(zhuǎn)錄和PCR參照TaKaRa公司的試劑盒說明書進(jìn)行操作。根據(jù)每個基因的NCBI的GenBank登錄號，設(shè)計(jì)定量PCR引物，引物序列如表1（qRT-p53和qRT-CEBPα）。RT-PCR的反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s；57℃退火30 s；72℃延伸15 s；經(jīng)過45個循環(huán)后72℃延伸10 min。

具體操作參考文獻(xiàn)[16］，取培養(yǎng)好的母豬卵巢顆粒細(xì)胞，細(xì)胞按比例加入裂解液，用槍吹打數(shù)下，研磨器研磨使裂解液和細(xì)胞充分接觸，充分裂解后，4℃高速離心機(jī)以12 000×g離心30 min，取上清，提取總蛋白后，立即測定蛋白濃度。取已定量蛋白，按1∶4的體積比加入5×protein loading buffer，沸水煮5 min，12 000×g離心3min，待用。上樣（考馬斯亮藍(lán)G-250法總蛋白定量，上樣量分別為80 μg總蛋白/個樣品）、SDS-PAGE膠電泳、蛋白轉(zhuǎn)膜、室溫封閉1.5 h，抗體孵育，ECL顯色，樣品膜放置暗箱中曝光定影，基因的灰度值與GAPDH內(nèi)參的灰度值比值代表基因蛋白的相對表達(dá)水平。

1.9 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析

DNASTAR分析基因序列；primer5.0 設(shè)計(jì) PCR引物；每個處理至少3個生物學(xué)重復(fù)，所有數(shù)據(jù)均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，并經(jīng)雙尾 T-test 檢驗(yàn)差異是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。**代表P＜0.01，*代表P＜0.05。

2 結(jié)果

2.1 豬 Kiss1基因上游區(qū)域生物信息學(xué)預(yù)測以及與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的鑒定

通過在線生物學(xué)軟件分析豬 Kiss1基因的-850—+221 區(qū)域序列，發(fā)現(xiàn)該區(qū)域存在p53（腫瘤抑制蛋白，tumor protein p53，p53）、CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白（CCAAT/enhancer binding protein, CEBP）、信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄活化家族Stat4（signal transducer and activator of transcription 4, Stat4）等轉(zhuǎn)錄因子的潛在結(jié)合位點(diǎn)，其中，在-744—-733處存在 CEBPα因子潛在結(jié)合位點(diǎn)，在-533—-523處存在的 p53潛在結(jié)合位點(diǎn)（圖2-A）。

圖2 豬Kiss1基因上游區(qū)域區(qū)結(jié)合潛在轉(zhuǎn)錄因子生物信息學(xué)預(yù)測以及轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合豬Kiss1基因上游區(qū)域的ChIP鑒定Fig. 2 Bioinformatics prediction for the potential binding site of transcription factors in the upstream region of porcine Kiss1, and ChIP results of transcription factors binding to the upstream region of porcine Kiss1 gene

p53的潛在結(jié)合序列為AGGCACATTC，CEBPα的結(jié)合序列為 AATAAGACAAT。使用轉(zhuǎn)錄因子 p53和CEBPα的特異性抗體，免疫共沉淀方式富集DNA；在潛在轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)附近設(shè)計(jì)引物，產(chǎn)物范圍為100—160 bp，以富集的DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，其結(jié)果見圖2-B。引物ChIP-p53和ChIP-CEBPα擴(kuò)增到了預(yù)期的DNA片段（圖2-B中p53和圖2-C中CEBPα泳道）；陰性對照（IgG）則沒有擴(kuò)增到相應(yīng)的DNA片段（圖2-B和圖2-C中IgG泳道）；陽性對照則獲得了預(yù)期大小的DNA片段（圖2-B和圖2-C中的Input和H3）。結(jié)果表明轉(zhuǎn)錄因子p53和CEBPα可通過相應(yīng)的DNA作用元件與豬Kiss1基因上游區(qū)域結(jié)合，分別特異性的結(jié)合在Kiss1基因-533—-523和-744—-733上。

2.2 轉(zhuǎn)錄因子p53對Kiss1基因表達(dá)的影響

分別轉(zhuǎn)染50、100、200和500 ng的pcDNA3.1-p53，發(fā)現(xiàn)隨著轉(zhuǎn)染質(zhì)粒濃度的增加，p53的mRNA水平顯著升高（P＜0.01）（圖3-A），說明p53的超表達(dá)載體具有轉(zhuǎn)錄活性，本研究選擇200 ng的濃度用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。與對照組相比，超表達(dá)p53能顯著降低Kiss1的mRNA水平（P＜0.05）（圖3-B）和蛋白水平（P＜0.05）（圖 3-C，D）。這些結(jié)果說明，超表達(dá)p53能降低Kiss1的mRNA和蛋白表達(dá)水平。

圖3 超表達(dá)p53對Kiss1基因表達(dá)的影響Fig. 3 The effects of over-expressed p53 on the expression of Kiss1

圖4 干擾p53的表達(dá)后對Kiss1基因表達(dá)的影響Fig. 4 The effects of interfering p53 on the expression of Kiss1

按照使用說明，瞬時轉(zhuǎn)染50 nM的p53-siRNA進(jìn)顆粒細(xì)胞。通過qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染p53-siRNA后，p53的mRNA水平顯著低于Scrambled組（P＜0.05）（圖4-A），說明p53-siRNA能有效的干擾轉(zhuǎn)錄因子p53的表達(dá)。與Scrambled組相比，p53-siRNA能顯著升高Kiss1的mRNA水平（P＜0.01）（圖4-B）和蛋白水平（P＜0.01）（圖 4-C，D），這些結(jié)果說明干擾轉(zhuǎn)錄因子p53的表達(dá)能上調(diào)Kiss1的mRNA和蛋白表達(dá)水平。

2.3 轉(zhuǎn)錄因子CEBPα對豬Kiss1基因表達(dá)的影響

分別轉(zhuǎn)染50、100、200和500 ng的pcDNA3.1-CEBPα，發(fā)現(xiàn)隨著轉(zhuǎn)染質(zhì)粒濃度的增加，CEBPα的mRNA水平顯著升高（P＜0.01）（圖 5-A），說明CEBPα的超表達(dá)載體具有轉(zhuǎn)錄活性，本研究選擇200 ng的濃度用于后續(xù)試驗(yàn)。與對照組相比，超表達(dá)CEBPα能顯著降低Kiss1的mRNA水平（P＜0.05）（圖 5-B）和蛋白水平（P＜0.01）（圖 5-C，D），這些結(jié)果說明，超表達(dá)CEBPα能降低Kiss1的mRNA和蛋白表達(dá)水平。

按照使用說明，瞬時轉(zhuǎn)染50 nmol·L-1的CEBPαsiRNA進(jìn)顆粒細(xì)胞。通過 qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染CEBPα-siRNA后，CEBPα基因的mRNA水平顯著低于 Scrambled組（P＜0.05）（圖 6-A），說明CEBPα-siRNA 能有效的干擾轉(zhuǎn)錄因子 CEBPα的表達(dá)。與Scrambled組相比，CEBPα-siRNA能顯著升高Kiss1的mRNA水平（P＜0.01）（圖6-B）和蛋白水平（P＜0.05）（圖6-C，D），這些結(jié)果說明干擾CEBPα的表達(dá)能上調(diào)Kiss1的mRNA和蛋白表達(dá)水平。

3 討論

圖5 超表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子CEBPα對豬Kiss1基因表達(dá)的影響Fig. 5 The effects of over-expressed CEBPα on the expression of Kiss1

Kiss1基因的突變將導(dǎo)致大鼠[12］和小鼠[17］的卵巢功能衰退，引起卵泡發(fā)育異常，阻礙卵泡成熟。同時，Kiss1可以影響小鼠卵巢黃體組織的形成[7,18］。這些研究結(jié)果說明，在人和哺乳動物卵巢卵泡成熟的過程中，Kiss1基因可以促進(jìn)卵巢卵泡的發(fā)育和排卵，但是目前關(guān)于Kiss1基因在豬卵泡中的表達(dá)機(jī)制尚不清楚。本研究主要以長大二元雜母豬的卵巢顆粒細(xì)胞為模型，擴(kuò)增豬的Kiss1基因上游區(qū)域，通過轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測網(wǎng)站預(yù)測其潛在結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子 p53和 CEBPα，通過ChIP鑒定p53和CEBPα結(jié)合到Kiss1基因上游區(qū)域相應(yīng)的位置（圖2），而且超表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子p53和CEBPα后，Kiss1基因的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著下降（圖3和圖5），干擾轉(zhuǎn)錄因子p53和CEBPα后，Kiss1基因的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著上升（圖4和圖6），這些結(jié)果說明，轉(zhuǎn)錄因子p53和CEBPα結(jié)合在Kiss1基因的上游區(qū)域，抑制Kiss1基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。

p53是一種抑癌基因，具有很多生物學(xué)作用，可以直接或間接通過調(diào)控靶基因，進(jìn)而促進(jìn)或抑制細(xì)胞生長、細(xì)胞增殖、血管生成和炎癥反應(yīng)等過程，此外，p53還具有活化DNA修復(fù)蛋白的作用[19-20］。p53可以調(diào)控其他靶基因發(fā)揮作用，例如p53可以下調(diào)PRR11-SKA2從而抑制腫瘤的生成[21］，上調(diào)miR-34c家族基因抑制癌癥的發(fā)生等[22］。研究表明，p53蛋白在人卵巢上皮癌組織中過表達(dá)[23］，抑制p53基因的表達(dá)后，卵巢癌細(xì)胞的增殖數(shù)目顯著減少，凋亡數(shù)目顯著增加[24］，此外，p53可以促進(jìn)人顆粒細(xì)胞的凋亡[25］，抑制豬卵巢顆粒細(xì)胞的增殖，激發(fā)凋亡標(biāo)記物MAP3K5基因的表達(dá)，從而影響孕酮、雌激素等性激素的分泌[26］。CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白（CCAAT/enhancer-binding proteins，CEBPs）是一類可以與DNA增強(qiáng)子結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子家族，其由 CEBPα、CEBPβ、CEBPγ、CEBPδ、CEBPε和 CEBPζ六個成員組成[27］，廣泛參與到細(xì)胞增殖分化、細(xì)胞凋亡、胚胎發(fā)育、機(jī)體能量代謝和免疫反應(yīng)等。

圖6 干擾轉(zhuǎn)錄因子CEBPα對Kiss1基因的影響Fig. 6 The effects of interfering p53 on the expression of Kiss1

研究表明，CEBPα的表達(dá)對小鼠的排卵、黃體生成和卵巢卵泡關(guān)鍵基因的表達(dá)起著至關(guān)重要的調(diào)節(jié)作用[28］。此外，CEBPα影響大鼠卵巢卵泡的發(fā)育和排卵[29］；上調(diào)CEBPα的表達(dá)能抑制合成FSH或者LH相關(guān)基因的表達(dá)，從而調(diào)控小鼠排卵及黃體形成[30］。這些研究說明，轉(zhuǎn)錄因子p53和CEBPα參與調(diào)控哺乳動物卵泡的成熟、顆粒細(xì)胞功能和黃體形成等繁殖活動，也佐證了Kiss1基因可能是影響母豬卵巢發(fā)育及成熟的重要候選基因。

4 結(jié)論

在豬卵巢顆粒細(xì)胞中，轉(zhuǎn)錄因子 p53和 CEBPα能結(jié)合到Kiss1基因-533—-523和-744—-733區(qū)域處，抑制其mRNA和蛋白的表達(dá)水平。此研究為Kiss1基因在豬卵巢顆粒細(xì)胞中表達(dá)調(diào)控在分子水平上提供理論依據(jù)。