蔡林林，胡海靜，衣曉坤，王虎虎，徐幸蓮，彭斌

（1南京農業(yè)大學江蘇省肉類生產與加工質量安全控制協(xié)同創(chuàng)新中心，南京 210095；2山東省煙臺市東方海洋科技股份有限公司，山東煙臺 246000；3新疆農業(yè)大學動物醫(yī)學學院，烏魯木齊 830052）

0 引言

【研究意義】隨著經濟的發(fā)展和人民生活水平的日益提高，食品安全問題也越來越受重視，而微生物引起的腐敗變質是影響食品安全的最主要因素。熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）是屬于假單胞菌屬（Pseudomonas）的嗜冷微生物，它具有極強的腐敗潛能[1-2］，可在低溫環(huán)境下生長繁殖。冷藏的高蛋白類和脂類豐富的食品一旦污染熒光假單胞菌，熒光假單胞菌便會大量繁殖，逐漸演變?yōu)閮?yōu)勢菌群，導致食品腐敗[3-4］。同時，隨著制冷設備的普及，冷藏食品在人類的飲食構成中占據了極大的比例，嗜冷的熒光假單胞菌對于人類而言便是一種潛在的威脅。目前已在豬肉[5］、牛肉[6］和雞肉[7］等冷藏肉制品中檢測到了大量的假單胞菌污染，嚴重影響產品貨架期。因此做好肉源性熒光假單胞菌的防范與控制對保障食品衛(wèi)生與安全具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】目前對加工車間及肉制品胴體表面等采用的消毒防控手段主要通過次氯酸鈉等化學消毒劑來進行，尤其是在中國，多數采用100—200 mg·L-1高濃度次氯酸鈉清洗5—10 min[8］。有研究報道高濃度次氯酸鈉可有效降低多種肉源性致病菌和包括假單胞菌在內的腐敗菌的活菌數[9-12］，但是在經次氯酸鈉消毒過后，其潔凈區(qū)和胴體等仍然有大量假單胞菌檢出[13-14］。此外，最近研究發(fā)現次氯酸鈉存在毒副作用，其與食品中的有機質反應可產生有害的含氯消毒副產物[15］，已不能滿足環(huán)保和高效殺菌的需要。酸性電解水是指含電解質的水溶液（生產實踐中常為氯化鈉）在電場作用下，消耗微量電能電解而成的具有殺菌功效的功能水，具有儲藏穩(wěn)定性好、殺菌范圍廣、制取方便、價格低廉等應用優(yōu)勢，室溫暴露時的不穩(wěn)定、短壽和低濃度的活性氯會在高效的殺菌處理后很快還原為普通水，因而綠色安全，近年來已廣泛應用于食品消毒、醫(yī)療衛(wèi)生和農業(yè)保鮮等領域[16］。目前酸性電解水殺菌效果的研究主要還是集中于對食品和加工接觸表面的食源性致病菌大腸桿菌[17-18］、單增李斯特菌、沙門氏菌[19-20］、金黃色葡萄球菌[21-22］、副溶血性弧菌[23］以及菌落總數的作用效果[24-25］?！颈狙芯壳腥朦c】雖有較多酸性電解水殺菌的研究報道，但是酸性電解水對肉源性腐敗菌假單胞菌的殺菌效果及假單胞菌的耐受響應尚不清楚。【擬解決的關鍵問題】本試驗以典型腐敗菌肉源性熒光假單胞菌為作用對象，從細胞水平上研究酸性電解水對肉源性熒光假單胞菌的抑制作用，為酸性電解水在食品中的應用及新型殺菌劑的研發(fā)提供一定的理論支持，為腐敗菌的控制措施提供新的思路。

1 材料與方法

試驗于2018年3—6月在南京農業(yè)大學國家肉品質量安全控制工程技術研究中心和生命科學實驗中心進行。

1.1 材料與試劑

熒光假單胞菌由筆者實驗室分離自腐敗雞肉，且在前期研究中發(fā)現該菌在不銹鋼表面的粘附性較高，具有較強的交叉污染能力[26］；胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA）、胰蛋白胨大豆肉湯（TSB）購于青島海博責任有限公司；LIVE/DEAD?BacLightTM細菌活性檢測試劑盒、Baclight Bacterial Membrane Potential Kit細菌膜電位檢測試劑盒、Pierce BCA Protein Assay Kit蛋白檢測試劑盒和Intracellular pH Calibration Buffer Kit 胞內 pH校準緩沖液試劑盒購于賽默飛世爾科技公司；BacTiter-GloTMMicrobial Cell Viability Assay ATP檢測試劑盒購于普洛麥格生物技術（北京）有限公司；BCECF-AM熒光探針購于東仁化學科技（上海）有限公司；4-羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）購于北京Coolaber試劑公司。

1.2 儀器與設備

酸性氧化電位水生成器（新宇光，山西）；Scan 1200自動影像分析菌落計數儀（Interscience，法國）；生物安全柜（Baker，美國）；高壓滅菌鍋（Hirayama，日本）；生化培養(yǎng)箱（博訊，上海）；BS223S電子天平（賽多利斯，北京）；高速冷凍離心機（Beckman，美國）；S-3000N掃描電子顯微鏡（Hitachi，日本）；M2e多功能酶標儀（IKA，德國）；流式細胞儀（BD，美國）；pH計（梅特勒-托利多，上海）；便攜式有效氯檢測儀（Hach，美國）等。

1.3 方法

1.3.1 菌懸液制備 將凍存于-80℃的肉源性熒光假單胞菌采用劃線法在TSA平板上活化，隨后挑取單菌落接種于6 mL TSB中28℃培養(yǎng)24 h。活化好的肉源性熒光假單胞菌以 0.9%的生理鹽水稀釋至 104CFU/mL，取1.5 mL接種于150 mL TSB培養(yǎng)基中，置于20℃下培養(yǎng)5 d。培養(yǎng)后的菌液經離心（6 000×g、15 min、4℃）去除上清液，清洗兩次后重新懸浮制成約108CFU/mL的菌懸液。

1.3.2 酸性電解水制備 在酸性氧化電位水生成器中加入不同濃度的 NaCl溶液，結合電流調節(jié)，制成不同濃度的酸性電解水，隨后立即采用便攜式有效氯檢測儀測定有效氯濃度（ACC），氧化還原電位值（ORP）采用 pH計在轉換電極后利用電位測定功能進行測定。所制備電解水的理化特性見表1。

表1 酸性電解水的理化特性Table 1 Physicochemical properties of acidic electrolyzed water

1.3.3 細菌存活數量 將0.5 mL上述制備的菌懸液加入4.5 mL酸性電解水中，充分混勻，分別處理5、10、15、20、25和30 min后，迅速吸取0.5 mL加入到4.5 mL中和劑（含0.8%硫代硫酸鈉的PBS緩沖液）中作用 1 min?；旌暇鶆蚝蟛捎脺缇睇}水進行梯度稀釋。本試驗吸取0.5 mL菌液加入4.5 mL 0.9%生理鹽水代替酸性電解水作為對照。取100 μL的稀釋液涂布于TSA平板上，28℃條件下培養(yǎng)24 h后計數。每組試驗重復5次。

1.3.4 菌體微觀結構 取1.3.3處理后的菌液，離心（3 000×g、15 min、4℃）去除上清液，使用2.5%的戊二醛固定液懸浮細菌并4℃靜置12 h，隨后30%、50%、70%、80%和90%梯度酒精脫水。最后使用100%酒精懸浮菌體。對處理好的樣品進行噴金，用掃描電子顯微鏡進行觀察、拍照。

1.3.5 細胞膜完整性 取上述菌液1 mL，調整菌濃度為107CFU/mL，將3 μL SYTO9和PI的混合染料加入到菌液中，充分混勻。室溫避光孵育15 min，使用流式細胞儀檢測熒光強度，其中綠色熒光染料SYTO9的激發(fā)波長為480 nm，發(fā)射波長為500 nm。紅色熒光染料PI的激發(fā)波長為490 nm，發(fā)射波長為635 nm。每組試驗重復3次。

1.3.6 細胞膜電位 取上述菌液1 mL，向菌液中加入 10 μL 30 mmol·L-1的熒光染料 DiOC2(3)，充分混勻，室溫避光孵育15 min后，立即用流式細胞儀測定熒光強度。每組試驗重復3次。

1.3.7 胞內ATP 取上述菌液100 μL加入到黑色酶標板中，隨后加入100 μL檢測工作液，充分混勻，25℃避光孵育 5 min，使用多功能酶標儀檢測化學發(fā)光強度。不含有菌懸液的生理鹽水為背景空白組，各試驗組的化學發(fā)光強度均減去背景空白組化學發(fā)光強度。每組試驗重復3次。

1.3.8 胞內pH 取上述菌液使用HEPES緩沖溶液洗滌菌體兩次，菌懸液中加入1 mmol·L-1BCECF-AM熒光染料使其終濃度為3 mmol·L-1，37℃避光孵育30 min，最后用 HEPES緩沖溶液清洗并懸浮菌體。試驗設置標準曲線組：分別使用pH為4.0、5.0、6.0、7.0和8.0的標定液，將8 μL尼日利亞菌素和纈胺霉素混合液添加到8 mL的pH標定液中，混勻。菌液離心去上清，以標定液懸浮菌體，37℃避光孵育10 min。將樣品及標準曲線組添加于黑色酶標板中，使用多功能酶標儀檢測樣品的熒光強度，設定激發(fā)波長為490 nm，發(fā)射波長526 nm，繪制標準曲線并計算樣品的胞內pH。每組試驗重復3次。

1.3.9 胞外聚合物 取1.3.3處理5 min菌液，生理鹽水清洗3次（5 000×g、10 min、4℃），第一次上清液作為松散胞外聚合物（L-EPS），收集沉淀。生理鹽水重懸沉淀至濃度為5 mg·mL-1（菌體濕重/生理鹽水體積），加入等體積2% EDTA-Na2溶液，混勻后4℃靜置3 h，離心取上清（14 000×g、20 min、4℃），0.22 μm濾膜過濾，分子截流量透析袋透析（3 500 Da、4℃、24 h）所得即為緊密胞外聚合物（B-EPS）。L-EPS和B-EPS中蛋白含量測定采用BCA試劑盒，總糖含量測定采用苯酚-硫酸法。以蛋白或總糖濃度（μg·mL-1）/菌體濕重（mg·mL-1）得到最終濃度（μg·mg-1）。每組試驗重復3次。

1.3.10 胞外聚合物對酸性電解水理化特性影響 胞外聚合物提取同1.3.7，取B-EPS 0.5 mL加入到4.5 mL電解水中，處理5 min后分別測定酸性電解水有效氯濃度（ACC）、氧化還原電位（ORP）和pH。每組試驗重復3次。

1.4 數據分析

結果以平均值±標準差的形式表示，采用 Excel軟件進行作圖分析，SPSS 13.0軟件對數據進行統(tǒng)計分析，對酸性電解水致死效果、膜完整性、膜電位、胞內ATP和胞內pH數據采用Duncan's ANOVA進行多重比較分析，對胞外聚合物含量變化和胞外聚合物對酸性電解水理化特性影響數據進行t檢驗比較分析。

2 結果

2.1 酸性電解水對肉源性熒光假單胞菌的致死效果

酸性電解水對肉源性熒光假單胞菌具有顯著的殺菌效果（P＜0.05），20和40 mg·L-1的酸性電解水在5 min達到相同的致死效果，曲線重疊，而在60 mg·L-1的酸性電解水處理5 min后，肉源性熒光假單胞菌活菌數已在檢出限之下（圖1）。

圖1 酸性電解水對肉源性熒光假單胞菌的致死效果Fig. 1 Bactericidal effect of acidic electrolyzed water on meat-borne P. fluorescens

2.2 菌落形態(tài)分析

由圖2-A可以看出，正常的肉源性熒光假單胞菌保持原有形態(tài)，呈桿狀，細胞完整，菌體表面飽滿光滑、無褶皺。而經酸性電解水處理后（圖2-B、C、D），菌體結構遭到破壞，大量細胞表面粗糙，凹凸不平，÷出現褶皺甚至變形，細菌細胞的受損程度隨著處理濃度的增加而增大。

2.3 細胞膜完整性的變化

由圖3可見，經酸性電解水處理后，肉源性熒光假單胞菌的膜完整性顯著降低（P＜0.05），經20 mg·L-1的酸性電解水處理的肉源性熒光假單胞菌細胞膜完整的比例僅有2.26%，經40和60 mg·L-1的酸性電解水處理的肉源性熒光假單胞菌細胞膜完整的比例則顯著降低至1.87%和1.20%。

圖2 肉源性熒光假單胞菌SEM圖Fig. 2 SEM observation of meat-borne P. fluorescens

圖3 酸性電解水對肉源性熒光假單胞菌膜完整性的影響Fig. 3 Effect of acidic electrolyzed water on the membrane integrity of meat-borne P. fluorescens

2.4 細胞膜電位的變化

由圖 4可見，經酸性電解水處理后，紅色熒光/綠色熒光強度呈現下降趨勢，說明酸性電解水對細胞膜產生了損害，膜電位消散。相比于對照，20 mg·L-1酸性電解水處理下紅/綠熒光比值降低了40%，而隨著處理濃度的增加，紅/綠熒光比值顯著降低，40 mg·L-1和60 mg·L-1酸性電解水紅/綠熒光比值均降低到對照的50%以內，酸性電解水濃度越增加，膜電位降低越顯著。

2.5 胞內ATP的變化

由圖5可見，酸性電解水可顯著降低肉源性熒光假單胞菌胞內ATP含量（P＜0.05）。5 min內化學發(fā)光值急劇下降，40和60 mg·L-1電解水處理對熒光假單胞菌胞內pH的降低無顯著影響，無明顯改變，驗證了酸性電解水對肉源性熒光假單胞菌細胞膜的破壞作用。

圖4 酸性電解水對肉源性熒光假單胞菌膜電位的影響Fig. 4 Effect of acidic electrolyzed water on the membrane potential of meat-borne P. fluorescens

圖5 酸性電解水對肉源性熒光假單胞菌胞內ATP的影響Fig. 5 Effect of acidic electrolyzed water on the intracellular ATP of meat-borne P. fluorescens

2.6 胞內pH的變化

由圖6可見，酸性電解水可顯著降低肉源性熒光假單胞菌胞內pH，高濃度酸性電解水的處理導致了胞內pH更顯著的降低（P＜0.05）。肉源性熒光假單胞菌初始胞內pH為7.5，經20、40和60 mg·L-1酸性電解水處理后，胞內pH分別降低了0.97、1.60和1.67。40和60 mg·L-1電解水處理對肉源性熒光假單胞菌胞內pH的降低無顯著影響。

圖6 酸性電解水對肉源性熒光假單胞菌胞內pH的影響Fig. 6 Effect of acidic electrolyzed water on the intracellular pH of meat-borne P. fluorescens

2.7 胞外聚合物含量的變化

酸性電解水處理下 EPS主要成分變化如表 2所示。由表中可以看出，酸性電解水處理顯著降低了L-EPS和B-EPS中蛋白和總糖含量（P＜0.05）。相比對照，L-EPS中蛋白、總糖含量分別降低了71.08%和62.29%，而 B-EPS中蛋白、總糖含量則分別降低了99.32%和40.62%。同時，L-EPS和 B-EPS中蛋白總糖的比值分別降低了23.46%和99.00%。

2.8 胞外聚合物對酸性電解水理化特性影響

由圖7可見，在胞外聚合物的添加下，各濃度酸性電解水ACC基本不變，沒有顯著影響（P＞0.05）。20和40 mg·L-1的酸性電解水相比于對照沒有顯著差異（P＞0.05），而胞外聚合物添加到60 mg·L-1酸性電解水后 pH顯著上升。胞外聚合物的添加顯著降低各濃度電解水的ORP（P＜0.05）。

表2 酸性電解水對肉源性熒光假單胞菌胞外聚合物中蛋白和總糖含量影響Table 2 Effect of acidic electrolyzed water on the protein and carbohydrate content of EPS from meat-borne P. fluorescens

3 討論

酸性電解水對肉源性熒光假單胞菌具有極強的殺菌效果，3種濃度在5 min內的細菌殺滅對數值均＞5，而濃度的增加顯著增強殺菌效果，表明酸性電解水是一種有效的殺菌劑。細胞膜的完整性是菌體正常生長代謝的一個主要因素，是細胞內外物質交換的主要屏障和介質，細胞膜不完整的細胞通常不能維持或產生穩(wěn)定的膜電位，并且胞內結構也暴露于外部環(huán)境之下，因此對于外部脅迫表現更為脆弱，通常也可以判斷為細胞死亡[27］。研究發(fā)現5 min處理下的細胞膜完整性急劇降低，且酸性電解水濃度越高，完整性越低。相似的結果也有報道[28-29］，研究發(fā)現存在大量的胞內物質泄露的現象，例如離子、蛋白、核酸等，表明細胞膜可能是酸性電解水的作用位點之一。有效氯是酸性電解水中的有效殺菌成分，其中HClO和ClO-發(fā)揮不同的作用。HClO由于其電中性及合適的分子大小可以先行透過細胞膜進入到細胞內部進行作用，抑制糖代謝進程，而離子態(tài)的ClO-無法直接通過細胞膜，會首先作用于細胞膜上的功能蛋白等成分，進而導致細胞膜運輸等功能的退化失效[16］，從而影響細胞膜完整性和通透性。細胞膜完整性所對應的細胞死亡程度低于平板計數結果，極少數細胞處于存活但不可計的狀態(tài)是可能原因。

圖 7 肉源性熒光假單胞菌胞外聚合物對酸性電解水有效氯濃度（A）、氧化還原電位（B）和pH（C）的影響Fig. 7 Effect of EPS of meat-borne P. fluorescens on the available chlorine concentration (A), oxidation- reduction potential (B) and pH (C) of acidic electrolyzed water

未經酸性電解水處理的細胞膜兩側外正、內負的狀態(tài)稱為膜的極化狀態(tài)，此時 Na+與 K+泵關閉。Na+是酸性電解水的主要成分之一，經酸性電解水作用后，Na+泵打開，胞內Na+濃度升高，肉源性熒光假單胞菌的膜電位降低，即表示細胞去極化。除了離子的透膜移動，環(huán)境 pH的變化也會引起膜電位的改變[30-31］。酸性電解水處理下細胞從中性環(huán)境到酸性環(huán)境的改變也會使細胞膜呈現去極化狀態(tài)。膜電位對大量細胞分裂蛋白的定位具有很重要的作用，而去極化則會導致細胞壁自溶酶的釋放進而引起細胞自溶[32］。同時，細胞膜完整性的下降導致了胞內ATP的釋放，而Na+和H+等離子的跨膜主動運輸也對胞內 ATP產生了大量消耗，從而引起了胞內ATP含量的降低，相似的結果前期[31,33］等也有報道。酸性電解水有效成分的進入可能降低胞內ATP合成速度的降低或加速ATP合成酶的水解，同樣也會導致胞內 ATP含量的降低。胞內pH對胞內DNA轉錄、酶活和蛋白合成等起著很重要的控制作用[34］。由于培養(yǎng)條件和菌種的不同，胞內pH往往在 5.6—9.0。酸化的胞內環(huán)境可以極大的提高殺菌劑的效果而導致細胞死亡[31］。研究發(fā)現胞內pH的降低與酸性電解水的濃度成正比。酸性電解水較低的pH帶來的大量H+流入是胞內pH降低的可能原因，胞內 pH的降低會干擾正常的胞內代謝進程，也會導致細胞對有效氯更為敏感。當面臨酸性或堿性外在脅迫時細菌有多種機制來維持質子穩(wěn)態(tài)，例如 H+-ATPase的合成，但是當這些機制或質子泵外排能力被質子進入能力超過時，胞內 pH最終將酸化到某個程度而導致胞內關鍵進程的瓦解，加速細胞的死亡。

EPS廣泛存在于細胞表面，表面吸附性強，可以形成保護層抵御殺菌劑和有毒物質的危害，其滲透阻礙性是細胞對殺菌劑的基礎抗性機制之一，因此殺菌劑能否穿透或破壞EPS從而接觸到活菌菌體對其殺菌效果具有很重要的影響[35］。EPS中的成分及其含量受菌種和培養(yǎng)環(huán)境的影響，相比于前期的一些研究，本研究中肉源性熒光假單胞菌產生的蛋白和總糖含量較高[36-37］。研究發(fā)現酸性電解水處理下EPS產生了一定的消耗，其中蛋白含量的降低遠高于總糖，表明EPS確實起到了一定的阻礙作用，相比于總糖，蛋白對酸性電解水殺菌效果的降低可能起到更大的作用。需氧微生物生活的環(huán)境中ORP通常為200—800 mV[38］，酸性電解水的ORP超過1 000 mV，其可改變微生物細胞的電子流，影響物質運輸、信息傳遞，引起細胞表面巰基混合物氧化，干擾胞內細胞代謝通路，從而影響其正常代謝和ATP合成，最終使其死亡。本研究發(fā)現EPS可以顯著降低酸性電解水的ORP，從而可能對酸性電解水的殺菌效果起削弱作用。EPS未能顯著降低酸性電解水的ACC和提高其pH，可能與其較低的添加量有關。

4 結論

酸性電解水可有效控制肉源性熒光假單胞菌，影響其細胞形態(tài)，降低細胞膜的完整性、胞內pH和胞內ATP的含量，引起細胞膜去極化。同時，胞外多聚物對酸性電解水具有一定的阻礙作用，削弱其致死效果。