趙曼，湯金榮，牛琳琳，陳琳，梁革梅

（1中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所植物病蟲害生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193；2河南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，鄭州 450002）

0 引言

【研究意義】目前商業(yè)化種植轉(zhuǎn)基因抗蟲植物中表達(dá)的多為蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis，Bt）蛋白，對鱗翅目（Lepidoptera）、鞘翅目（Coleoptera）或雙翅目（Diptera）等一些重要農(nóng)林害蟲具有顯著毒殺作用[1-2］。雖然轉(zhuǎn)基因抗蟲作物的種植有效地控制了靶標(biāo)害蟲的發(fā)生危害，減少了廣譜性化學(xué)殺蟲劑的使用，但其對非靶標(biāo)生物（尤其是捕食性天敵和寄生性天敵）的潛在影響也一直被大家所關(guān)注[3］。大草蛉（Chrysopa pallens）是我國農(nóng)田廣泛分布的一種重要捕食性天敵，主要以蚜蟲、粉虱、鱗翅目昆蟲卵及低齡幼蟲等為獵物，在害蟲生物防治方面具有非常重要的生態(tài)學(xué)價(jià)值，其幼蟲、成蟲皆可捕食，且食性廣、食量大，加上成蟲具有取食植物花粉和花蜜的習(xí)性，因此在轉(zhuǎn)基因作物田能通過取食植物花粉、花蜜或捕食 Bt蛋白靶標(biāo)昆蟲而直接或間接地接觸到抗蟲植物中表達(dá)的 Bt蛋白[4-5］。研究轉(zhuǎn)基因抗蟲植物中廣泛表達(dá)的Bt蛋白對大草蛉的生態(tài)安全性，對目前及未來新型轉(zhuǎn)基因抗蟲植物在我國的科學(xué)推廣應(yīng)用具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】任何一種轉(zhuǎn)基因抗蟲植物在任何一個(gè)國家或地區(qū)商業(yè)化推廣應(yīng)用前，都需要針對當(dāng)?shù)鼐哂兄匾鷳B(tài)功能且在田間可能接觸到 Bt蛋白的非靶標(biāo)節(jié)肢動(dòng)物，建立嚴(yán)格的生態(tài)安全性評價(jià)體系來研究抗蟲作物中表達(dá)的殺蟲物質(zhì)對這些重要非靶標(biāo)生物的潛在影響[6-7］。之前關(guān)于Bt作物或Bt蛋白對捕食性天敵瓢蟲或草蛉潛在影響的研究結(jié)果差異較大，有些報(bào)道認(rèn)為，Bt作物對捕食性自然天敵是安全的，另一些研究則認(rèn)為 Bt作物對天敵昆蟲的生長發(fā)育具有不利影響，然而進(jìn)一步分析造成不利影響的原因，發(fā)現(xiàn)天敵昆蟲通常通過取食對 Bt蛋白敏感的獵物而接觸到Bt蛋白，Bt蛋白影響靶標(biāo)獵物的營養(yǎng)質(zhì)量，從而進(jìn)一步影響天敵昆蟲的生長發(fā)育[8-11］。因此，在研究Bt蛋白或轉(zhuǎn)基因抗蟲植物對非靶標(biāo)生物的生態(tài)安全性時(shí)，為了避免獵物營養(yǎng)質(zhì)量而導(dǎo)致的假陽性評價(jià)結(jié)果，可以利用直接試驗(yàn)體系通過在天敵昆蟲食物源中加入高劑量Bt蛋白來評價(jià)Bt蛋白對捕食性天敵生長發(fā)育的直接影響，比如可以利用一些瓢蟲或草蛉成蟲具有取食植物花粉的習(xí)性，在植物花粉中混入 Bt蛋白，或在天敵昆蟲人工飼料中加入Bt蛋白的方法來研究取食Bt蛋白對捕食性天敵生長發(fā)育的直接影響[12-14］?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】盡管之前有一些研究報(bào)道了Bt作物或Bt蛋白對北歐草蛉（Chrysoperla carnea）和中華草蛉（Chrysoperla sinica）等草蛉類昆蟲的直接或間接影響，但關(guān)于Bt蛋白對我國棉田重要捕食性天敵大草蛉是否有不利影響尚未見系統(tǒng)的報(bào)道[15-16］。目前我國推廣應(yīng)用的轉(zhuǎn)基因抗蟲棉仍然為第一代抗蟲棉，只表達(dá)一種Bt蛋白，即Cry1Ac蛋白。殺蟲譜更廣、可以延緩靶標(biāo)害蟲抗性發(fā)展的能夠同時(shí)表達(dá)兩種 Bt蛋白的二代抗蟲棉已在美國、澳大利亞等多個(gè)國家商業(yè)化推廣種植[17］。未來能夠同時(shí)表達(dá)兩種或多種Bt蛋白的轉(zhuǎn)基因抗蟲棉在我國可能也會(huì)商業(yè)化推廣種植，因此，本研究通過建立合適的生物測定體系，綜合評價(jià)目前轉(zhuǎn)基因抗蟲棉中廣泛表達(dá)的幾種 Bt蛋白對大草蛉的生態(tài)安全性?！緮M解決的關(guān)鍵問題】建立Bt蛋白對大草蛉的安全性評價(jià)體系，明確目前轉(zhuǎn)基因抗蟲棉中廣泛表達(dá)的Bt蛋白對大草蛉的生態(tài)安全性，為未來在我國可能商業(yè)化推廣應(yīng)用的二代轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的生態(tài)安全性提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

試驗(yàn)于 2017年在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所完成。

1.1 供試材料

供試大草蛉采自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院河北廊坊基地，在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)以蠶豆蚜（Aphis craccivora）作為獵物進(jìn)行繼代飼養(yǎng)，蠶豆蚜以室內(nèi)培養(yǎng)的鮮嫩蠶豆苗作為寄主植物；棉鈴蟲（Helicoverpa armigera）敏感品系（96S）是在室內(nèi)用人工飼料飼養(yǎng)多代的敏感昆蟲，未接觸任何殺蟲劑，飼養(yǎng)方法參照文獻(xiàn)[18］。飼養(yǎng)環(huán)境條件為溫度（27±1）℃，相對濕度（75±5）%，光周期14 h∶10 h（L∶D）。

陽性對照物質(zhì)砷酸二氫鉀 PA（KH2AsO4）購自Sigma-Aldrich，使用前儲(chǔ)存于-20℃冰箱；供試 Bt蛋白Cry1Ac和Cry1F購自Envirologix，Cry2Ab蛋白來源于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所生物技術(shù)組，使用前均保存在-80℃超低溫冰箱備用。

1.2 供試Bt蛋白對大草蛉的生物學(xué)影響

PA對多種草蛉生長發(fā)育均具有胃毒作用，因此常被用作測定有毒物質(zhì)對草蛉生長發(fā)育潛在影響的陽性對照物質(zhì)[13］。本研究以添加PA的大草蛉人工飼料[19］作為陽性對照處理，通過在大草蛉人工飼料中添加不同Bt蛋白來研究供試3種Bt蛋白單獨(dú)作用或混合作用下對大草蛉生命表參數(shù)的影響。具體步驟：在準(zhǔn)備的新鮮大草蛉人工飼料中添加一定量單獨(dú)或混合的Bt蛋白，使蛋白在飼料中的最終濃度為500 μg·g-1FW（每克飼料鮮重），充分混勻后，參照王英麗等[20］所述方法將飼料加工成飼料囊，提供給初孵大草蛉幼蟲。試驗(yàn)設(shè)置處理包括：（1）大草蛉純?nèi)斯わ暳希瞻讓φ眨?；?）Cry1Ac處理（飼料中 Cry1Ac濃度 500 μg·g-1FW）；（3）Cry1F 處理（飼料中 Cry1F 濃度 500 μg·g-1FW）；（4）Cry2Ab 處理（飼料中Cry2Ab濃度500μg·g-1FW）；（5）Cry1Ac和 Cry1F 蛋白混合處理（飼料中 Cry1Ac和 Cry1F 濃度均為 500 μg·g-1FW）；（6）Cry1Ac和Cry2Ab蛋白混合處理（飼料中Cry1Ac和Cry2Ab濃度均為500 μg·g-1FW）；（7）PA處理（飼料中PA濃度為30 μg·g-1FW）。將初孵大草蛉幼蟲（＜12 h）單頭放置于大小為9.0 cm×1.5 cm的塑料培養(yǎng)皿中，第1天提供給大草蛉的食物為各處理人工飼料，第2天提供給大草蛉的食物為各處理人工飼料加蠶豆蚜（培養(yǎng)皿中同時(shí)提供飼料囊和剪成2 cm覆滿蠶豆蚜的蠶豆苗），之后照此方法重復(fù)交替提供給測試大草蛉。此外，培養(yǎng)皿中還放置一個(gè)濕潤的脫脂棉球作為大草蛉水源。每個(gè)處理重復(fù) 4次，每個(gè)重復(fù)包含 25頭大草蛉幼蟲，提供給大草蛉的各處理人工飼料囊每2 d更換一次。每日定時(shí)調(diào)查大草蛉幼蟲存活及蛻皮情況，并稱量4齡幼蟲和蛹的體重。待成蟲從蛹中羽化后，對大草蛉成蟲進(jìn)行性別鑒定并稱量雌、雄蟲體重。之后將同一處理的雌、雄蟲隨機(jī)配對，每對單獨(dú)飼養(yǎng)，人工飼料和蠶豆蚜的供給方法與幼蟲期相同。飼養(yǎng)成蟲的塑料培養(yǎng)皿中每日放入一段疊加的濾紙條（1 cm×5 cm）作為雌蟲產(chǎn)卵介質(zhì)，每天除調(diào)查雌、雄蟲存活情況外，還要記錄雌蟲產(chǎn)卵情況，成蟲期試驗(yàn)持續(xù)20 d（因大草蛉成蟲壽命長且產(chǎn)卵期較為分散，因此該生物學(xué)試驗(yàn)在成蟲期僅記錄含產(chǎn)卵高峰在內(nèi)的前20 d）。

1.3 大草蛉體內(nèi)Bt蛋白含量檢測

將另外一組大草蛉幼蟲，按照1.2所述人工飼料和蠶豆蚜混合交替飼養(yǎng)的方法，飼養(yǎng)在處理（1）至處理（6）的人工飼料上。飼養(yǎng)過程中，人工飼料和蠶豆蚜供給大草蛉的方式同1.2。在大草蛉生長發(fā)育過程中，收集不同處理中不同時(shí)期的大草蛉（4齡幼蟲、蛹和羽化4 d后成蟲）的樣品，用于測定大草蛉體內(nèi)不同Bt蛋白的含量。每個(gè)處理每個(gè)時(shí)期的大草蛉收集3個(gè)樣品，每個(gè)樣品包含5頭大草蛉。不同樣品中大草蛉體內(nèi)Bt蛋白濃度檢測方法為雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法（double-antibody sandwich enzyme-link immunosorbent assay，DAS-ELISA），具體測定方法參照各Cry蛋白定量測定試劑盒（Envirologix）說明書。

1.4 Bt蛋白穩(wěn)定性和生物活性檢測

為了明確不同處理飼料中混入 Bt蛋白的穩(wěn)定性和生物活性，分別取新鮮準(zhǔn)備的和在試驗(yàn)環(huán)境條件下暴露2 d的不同Cry蛋白處理飼料，每種處理飼料包含3次重復(fù)，其穩(wěn)定性利用ELISA法來測定，具體方法同1.3；生物活性測定方法參照文獻(xiàn)[21］，用敏感棉鈴蟲品系（96S）進(jìn)行測定。

1.5 取食Bt蛋白對大草蛉消化酶、解毒酶和保護(hù)酶活性的影響

大草蛉取食3種不同Bt蛋白處理飼料后，測定其體內(nèi)主要代謝酶系（消化酶、解毒酶和保護(hù)酶）的活性水平。測定的消化酶包括總蛋白酶（T-pro）、類胰蛋白酶（TPS）、類凝乳蛋白酶（CTP）和氨肽酶（AP）；解毒酶包括α-乙酸萘酯酯酶（α-NAE）、羧酸酯酶（CES）、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（GST）、乙酰膽堿酯酶（AChE）、酸性磷酸酶（ACP）和堿性磷酸酶（AKP）；測定的保護(hù)酶包括超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）和過氧化氫酶（CAT）。大草蛉樣品收集方法同1.3，除收集取食空白對照飼料和Bt處理飼料的大草蛉樣品，還需收集取食PA處理飼料的大草蛉各時(shí)期樣品。具體測定方法參照酶活測定試劑盒說明書（北京路遠(yuǎn)生物科技公司和南京建成生物研究所）。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 19.0軟件完成，不同處理間大草蛉的幼蟲發(fā)育歷期、蛹重和成蟲體重等生命表參數(shù)以及酶活性在SPSS軟件中進(jìn)行單因素方差分析后，再利用Dunnett's test進(jìn)行不同處理間的差異性比較，其中化蛹率和羽化率需轉(zhuǎn)換后再進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析；大草蛉人工飼料中Bt蛋白的穩(wěn)定性和生物活性采用Student's test進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 取食Bt蛋白對大草蛉生長發(fā)育的影響

與對照純?nèi)斯わ暳舷啾龋∈矪t蛋白處理飼料對大草蛉4齡幼蟲體重、幼蟲發(fā)育歷期、化蛹率、蛹重、蛹發(fā)育歷期、羽化率、成蟲體重和單雌總產(chǎn)卵量無顯著性影響（P＞0.05）；但取食PA處理飼料卻能夠使大草蛉幼蟲和蛹發(fā)育歷期極顯著延長，其他各測定生長發(fā)育參數(shù)則極顯著降低（P＜0.01）（表1）。

2.2 大草蛉體內(nèi)Bt蛋白含量檢測

在取食對照純?nèi)斯わ暳系拇蟛蒡润w內(nèi)（幼蟲、蛹及成蟲）未檢測到Bt蛋白；在取食不同Bt蛋白處理飼料的大草蛉幼蟲及成蟲體內(nèi)均檢測到了一定量的Bt蛋白，蛹內(nèi)也檢測到了少量的Bt蛋白，說明本研究生測體系所用的大草蛉人工飼料能夠?qū)⒒烊腼暳现械倪@3種Bt蛋白有效地傳遞給大草蛉（表2）。

2.3 大草蛉人工飼料中 Bt蛋白穩(wěn)定性和生物活性檢測

在新鮮和暴露2 d的大草蛉對照飼料中，未檢測到Bt蛋白；而Bt蛋白處理的飼料，在試驗(yàn)環(huán)境條件下暴露 2 d后，飼料中的 Cry1Ac濃度顯著降低（P=0.04），Cry1F和 Cry2Ab濃度降低不顯著（Cry1F：P=0.19；Cry2Ab：P=0.20）（圖 1-A）。敏感昆蟲生測結(jié)果表明（圖1-B），新鮮和在試驗(yàn)環(huán)境條件下暴露2 d的Bt蛋白處理大草蛉人工飼料的提取液加入棉鈴蟲飼料后飼喂敏感棉鈴蟲幼蟲，兩者死亡率差異不顯著（P＞0.05），但均極顯著高于無添加的棉鈴蟲人工飼料飼養(yǎng)的敏感棉鈴蟲的死亡率（P＜0.01）。

2.4 大草蛉取食Bt蛋白后體內(nèi)主要消化酶、解毒酶和保護(hù)酶活性

由圖2可知，空白對照組和Bt蛋白處理組間的大草蛉幼蟲和成蟲體內(nèi) 4種消化酶活性無顯著差異（P＞0.05），但陽性對照物質(zhì)（PA）處理組的大草蛉氨肽酶活性極顯著低于空白對照組，其他3種消化酶的活性則顯著或極顯著高于空白對照組（P＜0.05或P＜0.01）。取食純?nèi)斯わ暳虾腿∈?Bt蛋白處理飼料的大草蛉各解毒酶和保護(hù)酶活性差異也不顯著（P＞0.05），但取食 PA處理飼料的大草蛉體內(nèi)主要解毒酶和保護(hù)酶活性顯著或極顯著高于空白對照組（P＜0.05或P＜0.01）（圖3—圖5）。

表1 大草蛉取食純?nèi)斯わ暳稀⒑蠦t蛋白或PA的人工飼料的生命表參數(shù)Table 1 Life-table parameters of C. pallens fed on pure artificial diet or artificial diet containing different Bt proteins or PA

表2 大草蛉體內(nèi)Bt蛋白濃度Table 2 Bt protein concentration in C. pallens

圖1 新鮮飼料和暴露2 d的飼料中Bt蛋白濃度和生物活性Fig. 1 Concentration and bioactivity of Bt proteins in the artificial diets that were freshly prepared or had been exposed to C.pallens for 2 d

圖2 取食不同飼料的大草蛉體內(nèi)消化酶活性Fig. 2 Digestive enzyme activity of C. pallens fed on different diets

圖3 取食不同飼料的大草蛉4齡幼蟲體內(nèi)解毒酶活性Fig. 3 Detoxifying enzyme activity of C. pallens 4th instar larvae fed on different diets

3 討論

草蛉作為我國農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中常見的雜食性捕食天敵，其幼蟲和成蟲均能捕食害蟲，且食性廣、食量大，是一種具有重要生態(tài)功能的天敵昆蟲。草蛉成蟲具有補(bǔ)充營養(yǎng)的習(xí)性，在作物開花期或捕食獵物對象種群數(shù)量不足的情況下，還可取食農(nóng)田作物花粉，因此在轉(zhuǎn)基因抗蟲作物田，可以通過捕食Bt蛋白靶標(biāo)害蟲或取食轉(zhuǎn)基因抗蟲植物的花粉而直接或間接地暴露于轉(zhuǎn)基因抗蟲植物表達(dá)的Bt蛋白[22］。因此，常把草蛉這類捕食性自然天敵作為轉(zhuǎn)基因抗蟲植物環(huán)境安全性評價(jià)中對其非靶標(biāo)生物生態(tài)安全性評價(jià)的重要指示性物種[7,13］。

圖4 取食不同飼料的大草蛉成蟲體內(nèi)解毒酶活性Fig. 4 Detoxifying enzyme activity of C. pallens adults fed on different diets

在轉(zhuǎn)基因抗蟲植物對其非靶標(biāo)生物的安全性評價(jià)中，一般采用從實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)（lower-tier）到半田間試驗(yàn)（middle-tier），再到田間試驗(yàn)（higher-tier）的分層次評價(jià)系統(tǒng)，根據(jù)前一評價(jià)階段的評價(jià)結(jié)果來決定是否終止評價(jià)或進(jìn)入下一評價(jià)階段。實(shí)驗(yàn)室評價(jià)作為轉(zhuǎn)基因抗蟲植物對其非靶標(biāo)生物生態(tài)安全性評價(jià)的第一步，一般是在實(shí)驗(yàn)室理想可控環(huán)境條件下，通過將選擇的非靶標(biāo)生物暴露于高濃度殺蟲化合物下，來研究受試物種對轉(zhuǎn)基因抗蟲植物中表達(dá)殺蟲蛋白的敏感性。試驗(yàn)中所用殺蟲蛋白的濃度至少為其在田間環(huán)境中可能接觸量的10倍，甚至100倍以上。在實(shí)驗(yàn)室評價(jià)中，一般利用人工飼料試驗(yàn)（Tier-1），通過將高劑量殺蟲蛋白混入到評價(jià)生物的合適人工飼料中，來研究殺蟲蛋白對供試生物的直接毒性[19,23］。但 Tier-1生測體系的建立需要滿足3個(gè)條件：（1）合適的殺蟲蛋白載體，一般指待測生物的人工飼料，該飼料既能夠滿足供試生物正常的生長發(fā)育，又能將殺蟲化合物傳遞給供試生物（待評價(jià)昆蟲在該人工飼料上的幼蟲存活率≥80%）；（2）選擇一種與待評價(jià)殺蟲物質(zhì)作用方式相同的殺蟲化合物，作為轉(zhuǎn)基因植物對非靶標(biāo)生物生態(tài)安全性評價(jià)生測體系中的陽性對照物質(zhì)，用于驗(yàn)證所建立的Tier-1生測體系是否能夠檢測到殺蟲化合物對受試非靶標(biāo)生物的不利影響；（3）尋找一種能夠有效檢測殺蟲物質(zhì)在生測試驗(yàn)過程中穩(wěn)定性和生物活性的方法，以便于評估供試生物暴露于殺蟲化合物的實(shí)際程度[24］。

圖5 取食不同飼料的大草蛉體內(nèi)保護(hù)酶活性Fig. 5 Antioxidant enzyme activity of C. pallens fed on different diets

單純的人工飼料飼喂難以使大草蛉幼蟲存活率達(dá)到80%[25］，因此本試驗(yàn)采用人工飼料和蠶豆蚜交替混合飼喂的方式來飼養(yǎng)大草蛉，結(jié)果表明大草蛉在該飼養(yǎng)體系上能夠完成正常的生長發(fā)育，且幼蟲存活率＞80%，滿足Tier-1生測體系建立的基本要求。LI等[13］研究表明，砷酸二氫鉀（PA）對多種草蛉均具有胃毒作用，因此常被用作測定Bt蛋白對草蛉潛在毒性生測試驗(yàn)體系中的陽性對照物質(zhì)。本研究也利用 PA作為評價(jià)供試 Bt蛋白對大草蛉生長發(fā)育直接影響的陽性對照物質(zhì)，結(jié)果顯示飼料中添加 PA能夠顯著抑制大草蛉生長發(fā)育，說明試驗(yàn)所用Tier-1生測體系能夠檢測到對照殺蟲物質(zhì)對大草蛉的負(fù)面影響，而該體系的評價(jià)結(jié)果表明供試的3種Bt蛋白單獨(dú)或混合作用對大草蛉生長發(fā)育均無顯著性直接不利影響，這與之前其他 Bt蛋白對草蛉類昆蟲的生態(tài)安全性評價(jià)結(jié)果相一致[26］。

在Tier-1直接試驗(yàn)中，雖然殺蟲化合物以高于田間實(shí)際表達(dá)量至少 10倍的劑量混入到待評價(jià)生物人工飼料中，但并不代表選擇的非靶標(biāo)生物實(shí)際暴露于這么高的濃度，因?yàn)榇u價(jià)的殺蟲物質(zhì)在試驗(yàn)過程中可能會(huì)發(fā)生降解，從而失去毒性。因此，需要選擇一種合適的方法來監(jiān)測受試生物人工飼料中混入 Bt蛋白的濃度和生物活性，如利用蛋白免疫印跡法（Western blot）或ELISA法來檢測Bt蛋白在試驗(yàn)過程中的濃度變化[27-28］，后者與前者相比，其操作更簡便、測定更精確；試驗(yàn)過程中Bt蛋白的生物活性變化則利用對Bt毒素敏感的昆蟲來檢測[14］。本研究中大草蛉人工飼料每2 d更換一次，Bt蛋白穩(wěn)定性和生物活性測定結(jié)果顯示，Bt蛋白處理大草蛉飼料在試驗(yàn)環(huán)境條件下暴露2 d后，雖然其中的Bt蛋白濃度有一定程度降低，但其生物活性無顯著變化；大草蛉取食 Bt蛋白處理飼料后，在其幼蟲及成蟲體內(nèi)均檢測到了較高濃度的Bt蛋白，蛹內(nèi)也檢測到了少量Bt蛋白，說明該試驗(yàn)體系能將混入的殺蟲蛋白傳遞給大草蛉，大草蛉在整個(gè)試驗(yàn)過程中接觸到的均為高濃度的、具有生物活性的Bt蛋白，但對其生長發(fā)育并無顯著性不利影響。

在本研究建立的安全性評價(jià)體系中，Cry1Ac、Cry1F和Cry2Ab這3種Bt蛋白以單獨(dú)或組合的方式高劑量混入大草蛉人工飼料，對大草蛉生長發(fā)育無顯著性不利影響。進(jìn)一步測定了在昆蟲生長發(fā)育過程中起重要作用的主要代謝酶系的活性，發(fā)現(xiàn)直接取食含有高濃度Bt蛋白的大草蛉人工飼料，對大草蛉體內(nèi)主要消化酶、解毒酶和保護(hù)酶的活性均無顯著性影響，但取食 PA處理的飼料卻能顯著影響大草蛉體內(nèi)所測酶的酶活性。王英麗等研究表明，捕食性天敵取食轉(zhuǎn)基因抗蟲作物后，其體內(nèi)某些酶活性會(huì)發(fā)生變化，如蛋白酶、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶、過氧化物酶及超氧化物歧化酶等[20,29-30］。有報(bào)道認(rèn)為一些捕食性天敵取食轉(zhuǎn)基因抗蟲作物后，其體內(nèi)某些酶活性發(fā)生變化可能是由于轉(zhuǎn)基因抗蟲作物中次生物質(zhì)或營養(yǎng)物質(zhì)引起的，而非Bt蛋白所導(dǎo)致。綜合上述生物學(xué)及生理生化方面的評價(jià)結(jié)果，說明Cry1Ac、Cry1F和Cry2Ab對大草蛉是安全的。

4 結(jié)論

本研究所建立的直接試驗(yàn)評價(jià)體系可用于評價(jià)新型殺蟲蛋白或轉(zhuǎn)基因抗蟲植物對大草蛉的生態(tài)安全性，大草蛉取食高濃度活性Bt蛋白，對其生長發(fā)育及體內(nèi)主要代謝酶活性均無顯著不利影響，因此，目前轉(zhuǎn)基因抗蟲棉中廣泛表達(dá)的Cry1Ac、Cry1F和Cry2Ab對大草蛉是安全的。