王春燕

（四川師范大學生命科學學院 四川成都610066）

環(huán)境問題是當今國際社會的普遍問題，我國的環(huán)境問題也比較嚴重，其中，酸雨已成為生態(tài)學研究的熱點之一，因其對植物可能造成不可估量的損失，引起研究者們的廣泛關(guān)注［1]。隨著我國經(jīng)濟的迅速發(fā)展，化石燃料使用量的日益劇增，大氣質(zhì)量的日益下降，我國的酸雨問題日益嚴峻，已成為全球第三大酸雨區(qū)［2-4]。我國酸雨區(qū)主要分布在長江以南，其中西南、華南地區(qū)尤為嚴重，大部分降水的pH 值低于4.5［5]。有關(guān)酸雨對陸生植物生長發(fā)育及生理特性的影響國內(nèi)外已有較多報道，其中酸雨對黃瓜葉片、甜菜葉片、樺樹根系等抗氧化系統(tǒng)的研究表明，酸雨對SOD、POD、CAT 活性的影響隨著酸雨脅迫時間、脅迫強度及植物種類的不同而出現(xiàn)不同的規(guī)律［6]。酸雨會使植物葉片變黃脫落，破壞植物葉片結(jié)構(gòu)，降低葉綠素含量，影響植物酶活性［7]。

華重樓（Paris polypHyllavar. chinensis），又稱七葉一枝花，是我國傳統(tǒng)中藥，主要分布于我國西南部的云南、四川和貴州一帶，具有清熱解毒，消腫止痛、止血、治療跌打損傷、祛痰、抑菌、抗早孕等功效，是云南白藥、熱毒清、季德勝蛇藥片和宮血寧等中成藥的主要原材料［8]。華重樓為多年生草本植物，繁殖率較低，地下根狀莖生長十分緩慢，從種子發(fā)芽到入藥一般需10～15年。近年來，由于大量采挖，野生華重樓資源日益減少，嚴重威脅以其為原料的醫(yī)藥工業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，因此，人工栽培成為必然趨勢，而酸雨對華重樓栽培的影響不可忽視。本文主要以四川大渡河的華重樓為研究對象，通過不同pH 模擬酸雨溶液處理，研究酸雨脅迫對植物各項生理指標的影響及變化規(guī)律，為華重樓人工栽培管理提供科學依據(jù)［9-10]，為進一步開展酸雨環(huán)境對華重樓生長的脅迫機理和華重樓的逆境生理研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗地與材料

試驗地點為四川師范大學生物實驗園。該實驗園位于成都郊區(qū)，屬亞熱帶溫濕季風氣候，年平均降雨量為881.9mm，其中酸雨率為30%左右。每年7～9月為酸雨高發(fā)期，其中8月酸雨率最高，達到36.7%。

選擇長勢、形態(tài)基本一致的野生華重樓75株，2015年5月移栽入上、下口直徑分別為35、25cm，高30cm 的塑料花盆中，每盆1 株，對所有苗盆進行編號、掛牌，用壤土精細栽培，緩苗期間用自來水澆灌，6月開始噴灑酸雨。

1.2 方法

1.2.1 模擬酸雨溶液配制

用98%的濃硫酸和68%的濃硝酸配置3 種不同比例的母液：H2SO4∶HNO3（V/V）＝8∶1；H2SO4∶HNO3（V/V）＝1∶1 和H2SO4∶HNO3（V/V）＝1∶8，用蒸餾水將各母液稀釋成pH5.5、4.5、3.5、2.5 的酸雨噴灑液［11]。每次酸雨噴淋量根據(jù)當?shù)卦戮涤炅看_定。注意整個酸雨噴施試驗需在透光的塑料大棚中進行，以減少自然降雨的影響，同時用pH6.8的蒸餾水噴施作為對照。

1.2.2 試驗設計

采用完全隨機區(qū)組設計，將華重樓隨機分成5 組，每組15 株。根據(jù)成都地區(qū)多年月均降雨量計算每次模擬酸雨噴淋量，對各組華重樓植株分別噴淋已配制好的pH 值為2.5、3.5、4.5、5.5 的模擬酸雨溶液，每組噴淋相同pH 值溶液，不同組噴淋不同pH 值溶液，每次每盆植株的噴淋量約100mL，同時做對照試驗［12]。所有盆栽植株每隔7 d 噴淋一次。整個試驗期間除噴施酸雨的濃度不同外，其余環(huán)境條件保持一致。

1.2.3 測定指標與方法

酸雨脅迫處理7 d 后，隨機選擇不同組植株各3 株，選取長勢良好的葉片測定光合色素含量、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、丙二醛（MDA），每個生理指標測定3 次［13]，取平均值。葉面積測定采用SHY-150型活體掃描式葉面積儀。

鮮葉中葉綠素含量的測定：采用乙醇提取法分別測定665、649 和470 nm 的OD值，按公式計算組織中各色素的含量。

丙二醛（MDA）的含量測定：采用硫代巴比妥酸（TBA）法測定其含量［14]。

酶活性測定：采用愈創(chuàng)木酚法測定過氧化物酶（POD）活性［15]；氮藍四唑（NBT）光還原法測定超氧化物歧化酶（SOD）活性。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

采用Excel 2010 和SPSS 19.0 進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和單因素方差分析（One-way ANOVA），采用LSD 多重比較法檢驗各處理間差異顯著性（p＜0.05），并作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 酸雨脅迫對華重樓葉片的傷害

由表1可知，CK處理后，華重樓的葉片未出現(xiàn)可見傷害；pH5.5 酸雨處理后，華重樓葉片出現(xiàn)輕微傷害；隨著酸雨酸度的增加，華重樓葉片的傷斑面積隨之擴大。pH4.5 酸雨處理后，華重樓葉片出現(xiàn)較明顯的傷害；pH3.5 酸雨處理后，華重樓葉片出現(xiàn)明顯傷害；pH2.5 酸雨處理后，華重樓葉片出現(xiàn)傷斑。

表1 在不同酸度的模擬酸雨處理下華重樓葉片的傷害程度

2.2 酸雨脅迫對華重樓葉綠素含量的影響

由表2～3 可知，CK 處理后，華重樓葉片葉綠素含量最高；當pH5.5～6.8 時，華重樓葉片葉綠素含量與對照相差不大；pH低于4.5時，葉綠素含量急劇降低；與對照相比，pH 值為2.5 時，華重樓葉片葉綠素a、葉綠素b、葉綠素a + b 和葉綠素a/b分別降低了73.21﹪、67.21﹪、70.71﹪、17.98﹪。不同pH 模擬酸雨溶液處理下華重樓葉片的葉綠素總量和葉綠素a/b 含量均有一定程度的降低。pH3.5 模擬酸雨溶液處理的華重樓葉片內(nèi)葉綠素a和葉綠素總量達與對照差異顯著。

表2 模擬酸雨處理下華重樓葉片中葉綠素a和葉綠素b的含量

表3 模擬酸雨處理下華重樓葉片中葉綠素a+b的含量和葉綠素a/b比值

2.3 酸雨脅迫對華重樓葉片丙二醛含量的影響

由表4 可知，CK 處理華重樓葉片丙二醛（MDA）含量最低；pH5.5～6.8 時，隨著pH 的降低華重樓葉片MDA 含量迅速增加；pH3.5～5.5時，隨著pH 值的降低，華重樓葉片MDA 含量緩慢增加；當pH 值在2.5～3.5 之間時，隨著pH 值的降低，華重樓葉片MDA 含量迅速升高。與對照相比，pH2.5 時，模擬酸雨處理15、30、45 d 后華重樓葉片MDA 含量分別增加了52.43%、56.04%、29.16%，此時華重樓葉片受到嚴重傷害，膜脂過氧化作用增加，膜受到一定傷害，使丙二醛的含量急劇增加。

2.4 酸雨脅迫對華重樓葉片抗氧化酶活性的影響

在逆境脅迫下，植物體內(nèi)的活性氧數(shù)量劇增，植物的抗氧化酶活性迅速升高，對清除活性氧起到重要應激反應，成為環(huán)境脅迫下植物應激反應的重要檢測指標［16]。超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）是抗氧化酶系統(tǒng)中控制植物體內(nèi)活性氧積累的最主要的酶，SOD 是植物抗氧化的第一道防線，能清除細胞中多余的超氧陰離子；POD 可以使H2O2歧化成無毒害的水和氧分子。

表4 在不同酸度的模擬酸雨處理下華重樓葉片丙二醛的含量

2.4.1 酸雨脅迫對華重樓葉片過氧化物酶（POD）活性的影響

由圖1可知，pH5.5～6.8時，華重樓葉片過氧化物酶POD活性趨于穩(wěn)定；pH2.5～5.5時，華重樓葉片過氧化物酶POD 活性隨pH 值得的降低呈迅速上升的趨勢，其中pH2.5～3.5時，POD活性變化最為明顯。

圖1 模擬酸雨對華重樓葉片過氧化物酶POD活性的影響

2.4.2 酸雨脅迫對華重樓葉片超氧化物歧化酶（SOD）活性的影響

由圖2可知，用不同酸度的模擬酸雨處理華重樓15、30、45 d 后，華重樓葉片中超氧化物歧化酶（SOD）活性變化趨勢是一致的，都是隨著pH的降低，SOD活性呈迅速上升的趨勢。

3 討論

酸雨與植物互作是個非常復雜的過程，一方面酸雨破壞植物葉片表皮和細胞膜結(jié)構(gòu)，另一方面植物受到酸雨脅迫時，體內(nèi)的抗氧化酶系統(tǒng)激活，進而清除體內(nèi)由于酸雨脅迫引起過量的活性氧（ROS）［17]。有研究表明，施與植物適當強度的鍛煉或預脅迫，可以增強植物在逆境中的生存能力和抵抗力。本試驗通過模擬酸雨處理，華重樓葉片出現(xiàn)不同程度的可見傷害，同時葉片內(nèi)的SOD活性和POD活性均有不同程度的上升，這可能是由于酸雨脅迫過程調(diào)節(jié)的結(jié)果，在逆境中華重樓的抗氧化酶活性等生理指標也發(fā)生了明顯變化［18-19]。

圖2 模擬酸雨對華重樓葉片超氧化物歧化酶（SOD）活性的影響

酸性環(huán)境脅迫下，MDA 是反映膜脂過氧化程度以及膜結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性最直接的指標，可用于衡量細胞膜受傷害的程度［20]。酸雨可影響細胞活性氧代謝系統(tǒng)的平衡，破壞活性氧清除酶系［21]，有研究報道表明，酸雨使植物的丙二醛（MDA）含量增加，膜保護酶超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD），脂質(zhì)過氧化作用增強。SOD 活性增加，可抵抗由于酸雨造成體內(nèi)活性氧的增加，從而抑制膜脂的過氧化作用，但是倘若酸雨脅迫強度超過植物體SOD的耐受限度，則SOD活性會隨著pH值下降而逐漸喪失，甚至失去清除活性氧的能力［22]。

4 結(jié)論

酸雨對華重樓葉片可見傷害的典型癥狀是葉片退綠變淡，葉面有黃褐色傷斑；嚴重的會造成葉片枯萎，提前脫落。葉綠素是植物進行光合作用的主要色素，在光合作用的光吸收中起著核心的作用。酸雨脅迫下，植物的光合作用在可見傷害發(fā)生前已經(jīng)明顯受到抑制。本試驗中不同pH 值模擬酸雨處理條件下，華重樓葉片葉綠素a、葉綠素b、葉綠素a +b 和葉綠素a/b 的變化趨勢一致，都是隨著pH的增加而增加。

本試驗結(jié)果表明，華重樓葉片生長的各項指標對酸脅迫的敏感度不一樣。弱酸處理對華重樓葉片保護酶活性無顯著影響，但局部會有波動，這是受酸性條件脅迫后，華重樓葉片內(nèi)過氧化產(chǎn)物增多而啟動的一種應激機制。當葉片內(nèi)氧化產(chǎn)物積累到一定水平后，華重樓葉片內(nèi)保護酶（SOD，POD）活性隨酸性的增強而急劇降低。

目前，有關(guān)酸雨對藥用植物華重樓生長的影響研究不多，尤其是對華重樓抗氧化酶系統(tǒng)的研究較少。因此，有必要在研究華重樓抗氧化系統(tǒng)的同時考察植物次生代謝產(chǎn)物含量的變化，將華重樓的生理變化和有效成分研究相結(jié)合，將華重樓在逆境下各項變化與該藥材的形成與發(fā)展相結(jié)合。