陳生，楊志敏，周濱經，陳均，張啟鶴，曲召福

(佛山市南海區(qū)第四人民醫(yī)院，廣東 佛山 528211)

甲狀腺結節(jié)是一種常見的疾病，其檢出率達19%～67%，絕大多數(shù)甲狀腺結節(jié)是良性病變，通常無需治療，僅5%～15%甲狀腺結節(jié)是惡性腫瘤[1-3]。近年來世界范圍內甲狀腺癌發(fā)病率呈明顯上升趨勢，術前對甲狀腺結節(jié)的性質進行定性也變得更重要，診斷甲狀腺結節(jié)的良惡性、決定治療方案、監(jiān)測復發(fā)和預測疾病預后，以及基因治療都有十分重要的意義。本研究探討超聲引導下甲狀腺細針穿刺細胞學檢查(fine-needle aspiration biopsy，F(xiàn)NAB)與絲/蘇氨酸特異性激酶(serine-threonine protein kinase，BRAF)基因V600E聯(lián)合檢測對甲狀腺結節(jié)的臨床應用價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

2018年3月至2019年10月收治甲狀腺結節(jié)病例，符合術前細針穿刺條件的53例，其中男21例、女32例；患者年齡21～69歲，中位年齡45歲。

1.2 穿刺方法

對患者甲狀腺區(qū)域局部皮膚消毒后，在彩色超聲儀引導下，采用20 mL注射器配9號普通注射針頭，經皮刺入甲狀腺結節(jié)內，保持針管內持續(xù)負壓10 mL，提插針10～20次，直到所需的標本進入針頭柄及針管內，帶2 mL負壓拔針。

1.3 檢驗方法

1.3.1試劑準備 試劑盒平衡至室溫，充分融解、快速離心10 s；核算當次實驗所需要的反應數(shù)(n)，并根據(jù)反應體系配制方法計算當次實驗所需要的各種試劑量，依次配制600Glu PCR反應混合液和質控PCR反應混合液；按照23 μL/孔分裝量將配制好2管PCR反應混合液分裝至PCR反應管中；PCR反應管轉移至樣本準備區(qū)。

1.3.2樣本準備 提取樣本DNA，將待測樣本的基因組DNA、弱陽性對照、空白對照，分別加入已分裝2種PCR反應混合液的反應管中，即每個待測樣本分別用此2種PCR反應混合液進行檢測，加入量為2 μL/孔。待測樣本的基因組DNA 濃度為5～15 ng/μL；蓋好PCR反應管蓋，記錄樣本加樣情況。將PCR反應管轉移到核酸擴增區(qū)進行上機檢測。

1.3.3PCR擴增 取樣本準備區(qū)準備好的PCR反應管，放置在儀器樣品槽相應位置。設置儀器擴增相關參數(shù)，并開始進行PCR擴增。反應結束后，根據(jù)擴增曲線，劃定合適熒光閾值，得到不同通道Ct值并計算相關△Ct值。

1.3.4結果分析 反應結束后，根據(jù)擴增曲線劃定閾值，計算△Ct值(△Ct值=突變檢測Ct值-質控檢測Ct值)并進行結果判讀。

1.4 結果判定

1.4.1細胞病理判斷 所有穿刺標本均采用TB-SRTC報告系統(tǒng)，將細胞學結果總體分為6類：(1)標本無法診斷或不滿意；(2)良性病變；(3)意義不明確的細胞非典型病變/濾泡性病變；(4)濾泡性腫瘤/可疑濾泡性腫瘤；(5)可疑惡性腫瘤；(5)惡性腫瘤。本實驗將(5)、(6)類中組織學診斷為惡性者對應的細胞學標本歸為陽性，其余(1)～(4)類組織學診斷為良性者歸為細胞學陰性，(5)、(6)歸為細胞學陽性。

1.4.2BRAF基因檢測判斷 若樣本的FAM信號有明顯的擴增曲線，且Ct值<28時，則樣本為陽性，即BRAF基因V600E位點為突變型。反之若樣本突變信號無明顯擴增，或Ct值≥28時，判定為陰性，即BRAF基因V600E位點為野生型。

1.5 統(tǒng)計學分析

以甲狀腺術后病理組織學結果作為判定標準，將所有FNAC評估結果、BRAF基因突變檢測結果及兩者聯(lián)合檢測結果與之對比。應用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學分析，結果運用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

由表1～4可見，術前FNAC陽性符合率70.97%，術前BRAF基因突變檢測陽性符合率80.65%，F(xiàn)NAC聯(lián)合BRAF基因突變檢測陽性符合率93.55%，F(xiàn)NAC聯(lián)合BRAF基因突變檢測方法在符合率和靈敏度方面要明顯優(yōu)于單獨的FNAC或BRAF基因突變檢測這兩種方法(χ2=6.09，P<0.05)。

表1 術前FNAC與術后病理結果對比

表2 術前BRAF基因突變與術后病理結果對比

表3 FNAC聯(lián)合BRAF基因突變檢測與術后病理結果對比

表4 FNAC、BRAF基因突變檢測和聯(lián)合檢測三種方法的比較

3 討論

目前，臨床上鑒別良惡性結節(jié)的手段包括超聲、細針及粗針活檢、甲狀腺核素掃描。對于甲狀腺結節(jié)，F(xiàn)NAB已確定為準確率很高的診斷方法[4]；針對不同診斷結果分別釆用觀察、重復或手術等治療措施，大約10～30%甲狀腺結節(jié)不能明確性質[4]，包括非典型細胞、濾泡樣腫瘤、可疑惡性等3種類型，甲狀腺診斷策略對這部分病例建議重復穿刺或手術治療；診斷的不確定導致這部分患者在臨床上處理相對較為盲目[5-7]：選擇觀察，可能讓患者處于對病情過于擔心、焦慮和反復就診的狀態(tài)，選擇激進的診斷性外科手術，可能導致部分良性甲狀腺結節(jié)患者承擔不必要的手術風險及醫(yī)療費用支出。因此，術前獲得一種準確的診斷手段，就可以避免不必要的手術和二次手術。

近年來，許多研究學者將目光投入基因水平，BRAF是研究最多的癌基因之一，也是甲狀腺癌遺傳學改變最常見的突變基因。很多研究顯示在西方國家對BRAF基因單獨或結合其它癌基因的檢測明顯增加了的檢出率。在多數(shù)的文獻報道中，BRAF突變與腫瘤的發(fā)生和腫瘤的分化，以及腫瘤的侵襲性有關，常見于甲狀腺癌，是浸潤性腫瘤臨床表型和預后不佳的指標，其特異性和敏感性均較好，可以作為一個很好的診斷標志物[8-12]。甲狀腺結節(jié)BRAF基因通過點突變而被激活。最常見的是第1799位單個堿基錯義突變(T1799A)導致翻譯蛋白質第600位密碼子的纈氨酸(Valine)被谷氨酸(Glutamate)替換，成為活化蛋白質激酶(BRAF V600E)。其中甲狀腺癌BRAF突變有99%為BRAF V600E突變。乳頭狀癌遺傳學改變中最常見的類型就是BRAF V600E氨基酸置換且40%-45%的腫瘤已被確認會發(fā)生BRAF V600E突變[13]。典型的乳頭狀及高細胞甲狀腺癌、1/3的髓樣癌和未分化癌中都被證實有BRAF基因突變。去分化型擁有分化型甲狀腺癌的特點(如兩者都包括BARF基因突變)，這說明分化型可以進展為去分化型。一項多學科的研究表明，BRAF與淋巴結轉移，甲狀腺外擴散，疾病晚期(III期和IV期)及癌復發(fā)密切相關。之前還認為，BRAF基因突變與PTC復發(fā)后與放射碘親和力的缺失密切相關，致使放射性I131治療抵抗[14-17]。

鑒于BRAF基因突變與PTC的易轉移性及癌癥復發(fā)后放射碘親和力缺失密切相關，因此手術根治切除突變陽性的癌灶很重要。對于微小乳頭狀癌(小于或者等于1mm)術式的選擇上，美國甲狀腺協(xié)會推薦應該施行甲狀腺腺葉切除，但是如果術前檢測BRAF顯示陽性，推薦甲狀腺全切才安全。另外，大于5 mm的微小型甲狀腺乳頭狀癌也推薦全切，因為大于5 mm比小于5 mm的甲狀腺癌復發(fā)率將明顯提高。

本組病例對甲狀腺結節(jié)在超聲引導下行FNAC，并對樣本行BRAF基因檢測，將結果和病理結果對比，發(fā)現(xiàn)FNAC聯(lián)合BRAF基因檢測的結果符合率和靈敏度高于單獨的FNAC或BRAF檢測：聯(lián)合檢查的符合率是90.57%，優(yōu)于FANC的71.70%和BRAF基因檢測的79.25%，聯(lián)合檢查的靈敏度是93.94%，優(yōu)于FANC的77.50%和BRAF基因檢測的88.57%，提示聯(lián)合兩種檢測方法更優(yōu)于單獨的FNAC或BRAF檢測，聯(lián)合檢測能提高術前檢查的準確性。

綜上所述，甲狀腺結節(jié)術前FNAC聯(lián)合BRAF基因檢測比單純的術前FNAC檢查具有更高的陽性率和診斷價值，對于FNAC檢查中的假陰性或非典型病例，進行BRAF基因檢測也可在一定程度上對于鑒別良、惡性甲狀腺結節(jié)起到輔助作用。更為重要的是BRAF基因檢測可以為臨床判斷患者的預后、治療方式及分子靶向治療提供重要的參考依據(jù)。