敖俊紅，祝 賀，廖 勇，楊冬倩，李海濤，楊蓉婭

阿薩希毛孢子菌（Trichosporon asahii, T. asahii）是毛孢子菌屬中重要的臨床致病菌，可導(dǎo)致深部感染和夏季超敏性肺炎，T. asahii是播散性毛孢子菌病的主要病原菌[1,2]。近年來，隨著糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑的應(yīng)用，以及腫瘤、血液病、艾滋病的增多，該病發(fā)病率逐年上升[3-5]。T. asahii進入宿主體內(nèi)后是否致病，由宿主的免疫防御狀態(tài)和菌株致病力等因素決定。國際上報道由阿薩希毛孢子菌所致的播散性毛孢子菌病幾乎均是在惡性腫瘤、白血病基礎(chǔ)上繼發(fā)感染所引起。由阿薩希毛孢子菌引起的播散性感染較難治愈，癥狀容易反復(fù)，預(yù)后較差[6]。因此，了解宿主感染阿薩希毛孢子菌過程中限制保護性免疫應(yīng)答的因素可能為進一步研發(fā)有效的靶向治療措施提供免疫學(xué)理論基礎(chǔ)。CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞是一類可調(diào)節(jié)其他免疫細(xì)胞增殖、分化與功能，維持機體免疫穩(wěn)態(tài)和免疫耐受的CD4+T淋巴細(xì)胞亞群，在自身免疫性疾病、腫瘤、器官移植及慢性感染等疾病中發(fā)揮重要作用。轉(zhuǎn)錄因子Foxp3（forkhead box p3）是調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的特異性標(biāo)志，對調(diào)節(jié)性T細(xì)胞發(fā)育、分化及功能維持起重要作用[7]。研究發(fā)現(xiàn)在一些病原微生物如利士曼原蟲、單純皰疹病毒及白念珠菌等感染中，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞及細(xì)胞因子白細(xì)胞介素（IL）-10、轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）-β1參與炎癥免疫反應(yīng)并發(fā)揮保護性或有害性作用。本研究旨在觀察播散性阿薩希毛孢子菌病小鼠模型中CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表達情況，并探討其可能發(fā)揮的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種T. asahii標(biāo)準(zhǔn)株（CBS2479）購自荷蘭皇家學(xué)院真菌多樣性中心（CBS）。菌種-80℃保存，接種1個月前經(jīng)小鼠感染預(yù)試驗活化。

1.1.2 動物 BALB/c 雄性小鼠，50只，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物所提供，體重20～22 g，許可證號：SCXK-2012-0004。隨機分為試驗組和對照組（各25只）。

1.1.3 試劑 熒光抗體PE-Cy?5 Rat anti-mouse CD4、FITC Rat anti-mouse CD25、Rat anti-mouse Foxp3購自美國BD Biosciences公司；Trizol總RNA提取試劑盒購自英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司；FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；UltraSYBR Mixture購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；Foxp3和β-肌動蛋白引物由上海生物工程有限公司合成，引物序列如下：Foxp3：5"-TTCGAGGAGCCAGAAGAGTTTC-3"，5"-GGGCCTTGCCTTTCTCATC-3；內(nèi)參β-肌動蛋白：5"-CC ACAGCTGAGAGGGAAATC-3"，5"-TCTCCAG GGAGGAAGAGGAT-3"。

1.1.4 實驗儀器 ST16R高性能通用臺式冷凍離心機 （美國賽默飛世爾科技有限公司），型號為BD ACCURI C6流式細(xì)胞分析儀（美國BD Biosciences公司），ABI7000實時熒光定量PCR儀（美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）。

1.2 方法

1.2.1 接種 挑取單克隆菌落，接種于沙堡培養(yǎng)基（SDA）上培養(yǎng)7 d，以無菌生理鹽水沖洗培養(yǎng)基斜面收集菌落，將菌液經(jīng)12層無菌紗布過濾，血球記數(shù)板記數(shù)調(diào)整孢子懸液濃度為3.2×107cfu/ml。試驗組小鼠尾靜脈注射菌懸液每只0.3 ml，對照組小鼠尾靜脈注射生理鹽水每只0.3 ml。

1.2.2 取材 分別于接種后第3，7，14，21及28天，每次每組各取5只小鼠，3.6%水合氯醛（每只0.2～0.3 ml）麻醉小鼠后，超凈臺解剖小鼠并完整摘取脾臟，無菌生理鹽水沖洗干凈。

1.2.3 流式細(xì)胞儀檢測小鼠脾臟單個核細(xì)胞中Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比率 每次每只小鼠取1/3脾組織，用針?biāo)ㄑ心ズ?00目篩網(wǎng)過濾，PBS洗滌后取100 μl細(xì)胞懸液，加入PE-Cy?5 Rat anti-mouse CD4 5 μl，F(xiàn)ITC Rat anti-mouse CD25 5 μl，避光 4℃孵育30 min，用PBS 洗去游離的抗體，加紅細(xì)胞裂解液1 ml，5 min，PBS洗兩遍。加入新鮮配制固定/破膜劑1 ml，避光4℃孵育45 min，perm/wash buffer洗2遍，100 μl PBS重懸后加入PE Rat anti-mouse Foxp3 抗體 5 μl，避光 4℃孵育 50 min，PBS洗去游離的抗體，重懸后用流式細(xì)胞儀檢測CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞占CD4+T淋巴細(xì)胞的比率，未與抗體作用的細(xì)胞懸液作為空白對照。

1.2.4 實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）檢測小鼠脾臟Foxp3 mRNA相對含量 Trizol提取脾臟組織總RNA，按照FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒說明書操作步驟合成cDNA，應(yīng)用SYBR Green染料法，通過ABI7000定量PCR儀檢測。以相同的cDNA擴增目的基因，分別取cDNA 1 μl加入PCR八連管，依次加入UltraSYBR Mixture 10 μl,目的基因上下游引物各 0.5 μl，無菌蒸餾水 8 μl，構(gòu)成 20 μl反應(yīng)體系，每個樣品做3次重復(fù)。擴增條件：95℃預(yù)變性10 min，變性95℃10 s，退火60℃30 s，延伸72℃32 s，共40個循環(huán)。結(jié)果根據(jù)目標(biāo)基因和內(nèi)參基因β-肌動蛋白得到的Ct值，采用2-△△Ct法進行樣品間相對定量分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 小鼠脾臟單個核細(xì)胞Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比率

試驗組小鼠脾臟單個核細(xì)胞中CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的比例第3天為（7.33±0.49）%，與對照組（7.73±0.61）%相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；第7 天為（9.93±0.91）%，較對照組出現(xiàn)明顯上升（7.90±0.40）%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；第14天達到高峰，為（15.13±1.06）%，與對照組（7.60±0.56）%相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；其后逐漸下降，第21天為（11.03±0.85）%，與對照組（7.60±0.96）%相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；第28天降至正常水平（8.23±0.50）%，與對照組（7.53±0.51）%相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞ 0.05）（圖 1，2）。

圖1 不同感染時間小鼠脾臟組織CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞流式細(xì)胞圖

圖2 不同感染時間小鼠脾臟CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞比例

2.2 小鼠脾臟Foxp3 mRNA表達情況

試驗組小鼠脾臟Foxp3 mRNA表達水平第3天為（1.36±0.31），較正常對照組（1.13±0.41）升高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；第7天為（1.90±0.23），較對照組（1.30±0.37）升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05）；第 14天 為（2.59±0.55），較正常對照組（1.40±0.36）升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；第21天為（1.93±0.23），與對照組（1.38±0.36）相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05）；第 28天 為（1.26±0.22），與對照組（1.18±0.07）相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞ 0.05）（圖 3）。

圖3 不同感染時間小鼠脾臟Foxp3 mRNA表達水平

3 討論

調(diào)節(jié)性T細(xì)胞通過抑制效應(yīng)T細(xì)胞增殖及細(xì)胞因子的產(chǎn)生來維持免疫內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)[8]。在一些真菌感染性疾病中，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)目增多或功能增強，一方面可以避免過度炎癥反應(yīng)對感染部位造成的病理性損傷，對機體起到保護性作用；另一方面，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞抑制有效免疫應(yīng)答同時減弱機體清除病原微生物的能力，從而導(dǎo)致感染持續(xù)存在[9]。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞發(fā)揮免疫抑制作用主要通過兩種途徑：①通過細(xì)胞-細(xì)胞直接接觸抑制多種效應(yīng)細(xì)胞及抗原提呈細(xì)胞的活化與功能。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞膜表面組成性地高表達負(fù)性調(diào)節(jié)因子細(xì)胞毒素T淋巴細(xì)胞抗原-4(cytotoxin T lymphocyte antigen，CTLA-4)，CTLA-4可以與輔助性T淋巴細(xì)胞（helper lymphocyte T，Th）細(xì)胞表面共刺激分子CD28競爭性結(jié)合共刺激配體B7，在適應(yīng)性免疫應(yīng)答后期下調(diào)T淋巴細(xì)胞的活化。②分泌抑制性細(xì)胞因子作用于效應(yīng)T淋巴細(xì)胞，如IL-10、TGF-β1。IL-10不僅可以抑制Th1細(xì)胞合成干擾素（IFN）-γ，還可以抑制單核/巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞抗原提呈能力，具有抑制炎癥反應(yīng)的發(fā)展和減輕炎癥損傷的作用[10]。TGF-β1可以抑制巨噬細(xì)胞和NK細(xì)胞活化，阻斷活化T細(xì)胞的增殖和IL-2的產(chǎn)生，同時能促進誘導(dǎo)性調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞的分化，促進損傷組織的修復(fù)[11]。有研究發(fā)現(xiàn)，在白念珠菌、煙曲霉、副球孢子菌的感染過程中，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞及細(xì)胞因子IL-10、TGF-β1表達增高并抑制過度炎癥反應(yīng)，從而發(fā)揮保護性或有害性作用[12-14]。筆者既往研究也發(fā)現(xiàn)，IL-10、TGF-β1參與小鼠T. asahii感染后免疫應(yīng)答反應(yīng)，可能減弱了機體清除T. asahii的能力，為T. asahii的存活提供了有利條件[15]。

T. asahii引起的播散性感染會導(dǎo)致全身免疫系統(tǒng)的改變，為探討調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在T. asahii引起的播散性感染中作用機制，筆者對播散性毛孢子菌病小鼠脾臟中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞及其轉(zhuǎn)錄因子Foxp3 mRNA表達水平進行測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)試驗組小鼠在接種菌懸液后第7天，脾臟CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞及Foxp3 mRNA表達水平開始較正常對照組明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；在第14天達到最高值（最高可達正常對照組2倍），其后逐漸下降，至第28天下降至正常水平。以上研究結(jié)果表明，T. asahii可以誘導(dǎo)小鼠體內(nèi)CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在感染中后期表達增高，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞可能參與調(diào)節(jié)播散性毛孢子菌病的免疫應(yīng)答反應(yīng)，這與白念珠菌、煙曲霉、副球孢子菌等研究結(jié)果相似[12-14]。本研究結(jié)果表明，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞參與小鼠播散性毛孢子菌病感染免疫應(yīng)答反應(yīng)。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞可能抑制了機體抵御T. asahii感染的有效免疫應(yīng)答反應(yīng)，減弱了機體清除T. asahii的能力，為阿薩希毛孢子菌的存活提供了有利條件。但調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在播散性毛孢子菌病中發(fā)揮的確切免疫效應(yīng)及具體作用機制仍需進一步體內(nèi)和體外實驗研究。