郁建鋒，王中亮，張燕萍，胡 悅，徐 璐，龔道清，顧志良*

（1.揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 225009；2.常熟理工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，江蘇常熟 215500）

SIRT1 是Sirtuins 家族的成員之一，其通過(guò)對(duì)蛋白質(zhì)的去乙?；饔脜⑴c蛋白質(zhì)功能的調(diào)控[1-2]，如通過(guò)調(diào)節(jié)組蛋白和非組蛋白的活性進(jìn)而調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄，影響機(jī)體眾多生物學(xué)過(guò)程[3-4]，如細(xì)胞的增殖凋亡、應(yīng)激反應(yīng)和能量代謝等[5-7]。小鼠SIRT1 通過(guò)對(duì)甾醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1 c（Sterol Regulatory Element Binding Protein 1c，SREBP-1c）的去乙酰化作用抑制肝臟脂類合成基因的表達(dá)，如脂肪酸合成酶（Fatty Acid Synthase，F(xiàn)ASN）等，避免肝性脂肪變性[8-10]。禁食或胰高血糖素增加可以上調(diào)SIRT1 基因的表達(dá)[11]，促進(jìn)過(guò)氧化物酶體增殖活化的受體γ 協(xié)同激活因子1α（Peroxisome Proliferator Activated Receptor Gamma Coactivator 1α，PGC-Lα）的去乙?；?，調(diào)控與糖代謝相關(guān)酶類的表達(dá)[12-14]，還可以提高過(guò)氧化物酶體增殖活化的受體α（Peroxisome Proliferator-Activated Receptor α，PPAR α）的轉(zhuǎn)錄，增加小鼠肝臟的脂肪酸的β-氧化[15-16]，說(shuō)明SIRT1 在脂肪酸氧化及脂類代謝過(guò)程起著重要作用。肝臟是雞的主要能量代謝器官之一，在雞的糖脂代謝方面具有重要作用，脂肪組織中80%以上的脂肪酸由肝臟的從頭合成途徑產(chǎn)生[17]。本研究將以廣西三黃雞為研究對(duì)象，研究營(yíng)養(yǎng)應(yīng)激、高糖高脂對(duì)肝臟中SIRT1 及相關(guān)基因表達(dá)的影響，探討SIRT1 基因在雞肝臟中脂類代謝中的重要作用及機(jī)理，從而為解決在飼養(yǎng)過(guò)程中雞的脂類沉積問(wèn)題提供新的、重要的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)藥品和試劑 RNA 提取試劑RNAsio、反轉(zhuǎn)錄試劑 盒PrimeScript ? RT Reagent Kit （Perfect Real Time）、熒 光 定 量PCR 試 劑 盒SYBR?Premix Ex TaqTM（Tli RNaseH Plus）、DL2000 購(gòu)自寶生生物工程（大連）有限公司，棕櫚酸（ Palmitic acid, PA）購(gòu)自Sigma，山羊抗SIRT1 多抗（sc-19857）和小鼠抗β-actin 單抗（sc-47778）購(gòu)自圣克魯斯生物技術(shù)有限公司，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的驢抗山羊IgG（D110115）購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔抗鼠IgG（ab97046）購(gòu)自Abcam，Western/IP 裂解液和BeyoECL Plus A 液和B 液購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 引物設(shè)計(jì)和合成 根據(jù)NCBI GenBank（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/）數(shù)據(jù)庫(kù)中公布的雞SIRT1（NC_00 6093.4）、β-actin（NC_006101.4）、PGC-Lα（NC_006091.4）、PPAR α（NC_006088.4）、三酰甘油脂肪酶（Adipose Triglyceride Lipase，ATGL）（NC_006092.4）、FASN（NC_006105.4）的基因序列設(shè)計(jì)定量引物（表1），并由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 熒光定量PCR 引物序列

1.3 禁食實(shí)驗(yàn) 選用30 只同批次的30 日齡雄性廣西三黃雞，隨機(jī)分成A、B 和C 3 組，每組10 只。每組正常飼喂和飲水，溫度維持在26～28℃，飼養(yǎng)4 d 后，A組（對(duì)照組）維持原有的進(jìn)食、飲水，B 組和C 組進(jìn)行禁食處理（飲水正常）24 h 后，將A 組和B 組的雞稱重后屠宰采樣，頸動(dòng)脈采血，并采集各組織，液氮速凍后，存放于-80℃冰箱。C 組恢復(fù)進(jìn)食2 h 后，按上述方法進(jìn)行屠宰采樣，用全自動(dòng)血液分析儀測(cè)定血清中的葡萄糖、甘油三酯（TG），每組分別測(cè)定10 個(gè)樣本。

1.4 高糖、高脂對(duì)LMH- gSmiR30 細(xì)胞的作用 為進(jìn)一步探究SIRT1 基因?qū)﹄u肝內(nèi)脂代謝的作用，選用本實(shí)驗(yàn)室所構(gòu)建的SIRT1 基因低表達(dá)的雞肝癌細(xì)胞系LMH- gSmiR30，聯(lián)合用葡萄糖和PA 處理該細(xì)胞系，以3×105/mL 的細(xì)胞將LMH-pmirG 細(xì)胞（對(duì)照組）和LMH-gSmiR30 細(xì)胞鋪板于24 孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔0.5 mL Waymouth′s 完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清，100 ng/mL的G418），37℃、5% CO2培養(yǎng)24 h，PBS 洗滌1 遍后，換成含10% 胎牛血清的MEM 完全培養(yǎng)基，在實(shí)驗(yàn)組中添加終濃度為50 mmol/L 葡萄糖和0.2 mmol/L PA，培養(yǎng)48 h 后，收集細(xì)胞，提取總RNA，每次設(shè)3 個(gè)重復(fù)，重復(fù)3 次實(shí)驗(yàn)。其余的細(xì)胞進(jìn)行油紅染色：棄培養(yǎng)基，PBS 洗滌1 次后，加入100% 的丙二醇作用2 min，去除丙二醇，加入0.5 mL 0.5%的油紅（丙二醇配置的油紅），60℃處理60 min；去除油紅染料，加入85% 的丙二醇作用2 min，棄液后用流水洗3～5 min，晾干，甘油明膠封合，鏡下檢測(cè)。

1.5 總RNA 的提取及熒光定量分析 挑取適量的肝臟組織塊和培養(yǎng)細(xì)胞，按RNAsio 試劑說(shuō)明提取總RNA，用NanoDrop ND2000 進(jìn)行定量后，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒Prime Script ? RT Reagent Kit（Perfect Real Time） 對(duì)RNA樣品進(jìn)行RT 反應(yīng)合成cDNA；然后以β-actin 為內(nèi)參，用熒光定量PCR 試劑盒SYBR?Premix Ex TaqTM（Tli RNaseH Plus）對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行定量檢測(cè)，體系：10 μL 2×SYBR Green Premix Ex Taq（Tli RNaseH Plus），0.4 μL Forward primer （10 μmol/L），0.4 μL Reverse primer（10 μmol/L），0.4 μL ROX Reference Dye II（50×），2.0 μL 上述RT 產(chǎn)物稀釋液，H2O 補(bǔ)足至20 μL；反應(yīng)條件：95℃ 30 s，（95℃ 5 s，60℃ 34 s）40 個(gè)循環(huán)，PCR 反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行熔解曲線分析，收集數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.6 SIRT1 基因的蛋白質(zhì)表達(dá)水平的檢測(cè) 挑取適量的肝臟組織塊，用液氮碾磨后，用含1 mmol/L 苯甲基磺酰氟（Phenylmethanesulfonyl Fluoride，PMSF）的Western/IP裂解液裂解組織和細(xì)胞，提取總蛋白，并用BCA（Bicinchoninic Acid）法測(cè)定總蛋白濃度。取35 μg總蛋白，以10% 的SDS-PAGE 進(jìn)行蛋白質(zhì)電泳分離，然后通過(guò)濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)印至聚偏氟乙烯膜（Polyvinylidene Fluoride，PVDF），用含5% 脫脂奶粉的TBST（Tris Buffered Saline With 0.1% Tween-20，pH 7.4，TBST）緩沖液將PVDF 膜封閉過(guò)夜后，用TBST 充分漂洗（3次，每次10 min），然后在4℃條件下分別用山羊抗SIRT1 多抗TBST 以1∶250 稀釋）和小鼠抗β-actin 單抗（TBST 以1∶250 稀釋）孵育過(guò)夜；再次用TBST 充分洗滌PVDF 膜后，分別用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的驢抗山羊IgG（TBST 按1∶20 000 稀釋）和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔抗鼠IgG（TBST 按1∶20 000 稀釋），室溫（21～25℃）孵育2 h；在TBST 充分洗滌PVDF 膜后，用等體積混合的BeyoECL Plus A 液和B 液混合液處理PVDF 膜進(jìn)行曝光。

1.7 統(tǒng) 計(jì)分析 采 用2-ΔCt法對(duì)熒光 定 量PCR 結(jié) 果 進(jìn)行分析，獲得相關(guān)基因的表達(dá)結(jié)果，采用ImageJ 軟件對(duì)Western blot 結(jié)果進(jìn)行灰度分析，獲得目標(biāo)基因的蛋白表達(dá)水平，然后分別用t 檢驗(yàn)和ANOVA 方差分析法對(duì)以上獲得的數(shù)據(jù)分別進(jìn)行組內(nèi)、組間的統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 禁食對(duì)雞血清葡萄糖糖、血脂變化的影響 由表2可知，與A 組相比，B 組在禁食24 h 后的血清葡萄糖約為A 組的90%；C 組在禁食24 h 后恢復(fù)采食2 h，血清葡萄糖糖濃度迅速恢復(fù)至17.565 mmol/L，較A 組和B 組分別增加了14.3%和27.5%，3 組間的血清葡萄糖糖變化存在差異顯著（P＜0.01）。B 組雞在禁食24 h后血液中TG 顯著下降至A 組的20% 左右，C 組恢復(fù)2 h 采食后TG 迅速升至A 組的50%左右（P＜0.01）。上述結(jié)果表明，在雞禁食過(guò)程中，血液中的TG 變化程度比葡萄糖變化程度更明顯。

表2 禁食對(duì)雞血糖和TG 濃度的影響（n=10） mmol/L

2.2 饑餓對(duì)雞肝臟SIRT1 及糖脂代謝相關(guān)基因的表達(dá)影響 表3 和圖1 顯示，與A 組相比，B 組中SIRT1基因的mRNA 水平增加了1.27 倍（P＜0.01），SIRT1蛋白水平增加了87.4%（P＜0.05），C 組中SIRT1 的mRNA 和蛋白質(zhì)水平均顯著下降，甚至低于A 組。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)（表4），PGC-Lα、PPAR α 和ATGL 的mRNA 轉(zhuǎn)錄水平的變化趨勢(shì)與SIRT1 基因基本一致，禁食后，分別增加了7.77、1.46、2.26 倍（P＜0.01），恢復(fù)采食2 h 后，PGC-Lα、PPAR α、ATGL 基因的mRNA水平也迅速降至A 組水平。而FASN 基因mRNA 水平的變化與SIRT1 基因相反，禁食后顯著降低至A 組的1/13 左右（P＜0.01），恢復(fù)采食后回升至A 組的1/4（P＜0.01）。以上基因的表達(dá)變化與血液中葡萄糖和TG 濃度的變化相對(duì)應(yīng)，這暗示SIRT1 及其他基因在雞禁食過(guò)程中對(duì)肝臟的糖脂代謝反應(yīng)起著重要作用。

2.3 高糖、高脂對(duì)肝細(xì)胞內(nèi)SIRT1 及其下游基因表達(dá)的影響 油紅染色結(jié)果顯示，與LMH-pmirG 細(xì)胞相比，LMH- gSmiR30 細(xì)胞經(jīng)50 mmol/L 葡萄糖和0.2 mmol/L PA 處理48 h 后，其胞內(nèi)的脂滴形成更為明顯（圖2）。熒光定量結(jié)果顯示，SIRT1、PPAR α 和FASN 基因的mRNA 表達(dá)水平在LMH-pmirG 和LMH-gSmiR30 細(xì)胞中均受到不同程度抑制（表5），但在2 種細(xì)胞間差異不顯著。高濃度的葡萄糖和PA 抑制了ATGL 在LMH- gSmiR30 中mRNA 表達(dá)水平，但在LMH-pmirG 中未受到明顯影響，說(shuō)明SIRT1 基因的低表達(dá)抑制了LMH細(xì)胞中ATGL 對(duì)高糖高脂的應(yīng)答表達(dá)，致使細(xì)胞內(nèi)脂解反應(yīng)減少。因此，LMH- gSmiR30 細(xì)胞在高糖高脂的培養(yǎng)條件下更易在細(xì)胞內(nèi)形成脂滴。

表3 禁食后雞肝臟中SIRT1 基因的表達(dá)

圖1 禁食后雞肝臟中SIRT1 蛋白的Western blot 檢測(cè)結(jié)果

表4 禁食后雞肝臟內(nèi)糖脂代謝相關(guān)基因mRNA 表達(dá)水平（n=8）

圖2 細(xì)胞內(nèi)脂滴的油紅染色結(jié)果

表5 高糖、高脂對(duì)LMH-gSmiR30 細(xì)胞系中SIRT1 及糖脂代謝相關(guān)基因mRNA 表達(dá)水平的影響（n=3）

3 討 論

肝臟是動(dòng)物體最主要的代謝器官之一，在營(yíng)養(yǎng)、能量平衡調(diào)節(jié)中起著最為重要的作用[15,18]。研究發(fā)現(xiàn)，盡管雞的血糖值在禁食24 h 后有所下降，且恢復(fù)飼喂后快速回升，但血糖濃度在一個(gè)相對(duì)小的范圍內(nèi)上下波動(dòng)，而TG 的變化非常明顯，禁食24 h 后血脂的濃度明顯低于正常飼喂組，恢復(fù)采食后血脂濃度雖然也低于正常組，但比禁食組回升明顯，這些指標(biāo)的變化與肝臟在禁食過(guò)程中發(fā)揮的作用密不可分，肝臟在機(jī)體禁食階段可以通過(guò)肝糖原的動(dòng)員產(chǎn)生葡萄糖，補(bǔ)充降低的血糖濃度，增加脂類的分解和促進(jìn)脂肪酸的氧化代謝，滿足機(jī)體對(duì)能量的需求[19]。

肝臟中的糖脂代謝相關(guān)基因的表達(dá)在禁食24 h 后都發(fā)生了不同程度的變化，這也印證了以上推斷，如SIRT1、PGC-Lα、PPAR α 和ATGL 等 基 因 的mRNA 水平表達(dá)顯著增加，恢復(fù)飼喂2 h 后又快速下降，且這4 個(gè)基因的變化趨勢(shì)相一致。研究報(bào)道，在肝臟的糖異生中，SIRT1、Pgc1α 有著重要作用[20-21]，SIRT1 在表達(dá)水平和蛋白修飾水平參與PGC-Lα 基因功能的調(diào)節(jié)。在小鼠中，特異性敲低SIRT1 基因的表達(dá)后，PGC-Lα的表達(dá)顯著減少，其調(diào)控的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶激酶的表達(dá)也明顯減少，如果小鼠PGC-Lα 中的第13 位上的賴氨酸突變?yōu)榫彼?，可以抑制其被乙?；莿t將會(huì)大幅升高，特別是在短期禁食期間，這種效應(yīng)更為明顯[15]。因此，禁食24 h 后SIRT1、PGC-Lα 基因的表達(dá)升高可能促進(jìn)了雞肝糖原的分解產(chǎn)生葡萄糖，補(bǔ)充血循環(huán)中的葡萄糖，緩解短期禁食造成的血糖變化。

而禁食24 h 后TG 大幅減少，這可能與機(jī)體通過(guò)增加脂肪酸的氧化和抑制脂類合成有關(guān)。SIRT1-PGCLα- PPAR α 與脂肪酸的氧化代謝密切相關(guān)，在脂類代謝中也發(fā)揮著重要作用[15-16]，SIRT1、PGC-Lα 和 PPAR α 基因在雞禁食后的表達(dá)迅速升高可能是造成其血液中TG 大幅減少的原因之一。同時(shí)，ATGL 基因在禁食后的表達(dá)也顯著升高。有研究發(fā)現(xiàn)，ATGL 可以對(duì)肝臟脂滴進(jìn)行脂降解，產(chǎn)生脂肪酸，促進(jìn)PGC-Lα/PPAR α 的信號(hào)通路，增加脂肪酸的氧化和線粒體生物反應(yīng)[22]，ATGL 還可以通過(guò)SIRT1 引起肝臟脂滴的自噬和脂解，小鼠肝臟特異性敲除ATGL 基因可以導(dǎo)致脂肪在肝臟內(nèi)的堆積，同時(shí)下調(diào)SIRT1 的活性及PPAR α/PGC-Lα 靶基因的表達(dá)和下調(diào)線粒體的生物反應(yīng)及β-氧化[23]，這可能也是在禁食后雞血液中TG 顯著降低的原因。本研究還發(fā)現(xiàn)，在LMH-gSmiR30 中，SIRT1 基因的低表達(dá)導(dǎo)致ATGL 基因的表達(dá)有所下調(diào)，而且高濃度的葡萄糖和PA 可以加重這一反應(yīng)，說(shuō)明SIRT1 基因表達(dá)的減少抑制了ATGL 基因?qū)Ω咛?、高脂的?yīng)答性表達(dá)，減弱了肝細(xì)胞對(duì)脂肪的脂解作用[24]，而FASN 基因在LMH-pmirG 和LMH-gSmiR30 細(xì)胞中均受到高糖高脂的抑制，兩者之間表達(dá)差異不明顯，說(shuō)明在高富營(yíng)養(yǎng)的培養(yǎng)條件下LMH 細(xì)胞中脂滴形成增加，而LMHgSmiR30 胞內(nèi)的脂滴形成更多的原因是由于SIRT1 基因細(xì)胞中的低表達(dá)降低胞內(nèi)脂解代謝水平，而非通過(guò)增加脂類的合成造成的。由此可見，SIRT1-ATGL 在雞肝或肝細(xì)胞內(nèi)脂類的分解中可能發(fā)揮著重要作用。

4 結(jié) 論

綜上所述，雞SIRT1 基因的表達(dá)量與肝內(nèi)的糖脂、能量代謝密切相關(guān)，禁食和能量限制可以增加SIRT1基因的表達(dá)；富營(yíng)養(yǎng)條件下，LMH 細(xì)胞中SIRT1 基因的低表達(dá)降低了ATGL 基因的表達(dá)，影響肝細(xì)胞內(nèi)脂肪的脂解途徑，促進(jìn)胞內(nèi)脂滴的增加。