王 鑫，苑洪霞，駱金紅，許厚強，陳 祥*

（1.貴州大學(xué)高原山地動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室，貴州貴陽 550025； 2.貴州省動物遺傳育種與繁殖重點實驗室，貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，貴州貴陽 550025）

肉品質(zhì)性狀是受遺傳和環(huán)境因素影響的復(fù)雜表型性狀。遺傳因素主要表現(xiàn)在動物出生前肌肉的形成，出生后則為肌纖維體積的增大。研究表明，肌肉組織的形成和出生后的生長主要由生肌調(diào)節(jié)因子（Myogenic Regulatory Factors，MRFs）基因家族來調(diào)控[1-2]。MRFs家族控制著肌細(xì)胞的增殖和分化，與肌纖維的數(shù)量和大小密切相關(guān)，對肉品質(zhì)和風(fēng)味有重要影響[3]。MRFs 大體可分為2 種，一種為在成肌細(xì)胞增殖過程中最先表達(dá)的初級MRFs，由Myod1 及Myf5 組成，在生肌細(xì)胞系的定向完成中起調(diào)節(jié)作用[1]；另一種是由MyoG 及Myf6 組成的次級MRFs，它們進(jìn)一步完成肌纖維的形成[4]。Klosowska 等[5]研究發(fā)現(xiàn)，Myf5 影響肌束中快肌類型的比例和肌纖維的代謝性能從而影響肉質(zhì)。郭月英等[6]研究發(fā)現(xiàn)，Myf6 基因多態(tài)性與巴美肉羊、小尾寒羊肉品質(zhì)存在相關(guān)性。趙丹璐等[7]研究發(fā)現(xiàn)，Myf5 基因表達(dá)量與山豬肉品質(zhì)相關(guān)蛋白質(zhì)呈顯著的正相關(guān)。

黔北麻羊?qū)俣堂?、皮肉兼用品種，具有適應(yīng)性強、耐粗飼、繁殖率高、產(chǎn)肉性能良好、膻味輕、肉鮮美可口等優(yōu)點，為貴州三大地方山羊品種之一[8]，2009 年12 月被中華人民共和國農(nóng)村農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)為國家新的遺傳資源[9]。關(guān)于Myf5、Myf6 基因在黔北麻羊不同組織部位表達(dá)差異性的研究尚未見報道。本實驗利用熒光定量RCR 法對同齡黔北麻羊和努黔F1代不同組織中Myf5 和Myf6 基因表達(dá)進(jìn)行比較分析，為進(jìn)一步研究Myf5、Myf6 基因?qū)η甭檠蚣∪馍L和肉品質(zhì)影響的作用機理提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集 隨機選取相同飼養(yǎng)條件下（貴州省習(xí)水縣黔北麻羊中心產(chǎn)區(qū)）健康的12 月齡黔北麻羊和努黔F1代公羊各3 只，分別采集心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、背最長肌、股二頭肌和臂三頭肌8 種組織，液氮短暫保存運回實驗室，于-80℃冰箱備用。

1.2 組織RNA 的提取 采用Trizol 法提取各組織總RNA，對提取的總RNA 用1.2% 瓊脂糖凝膠電泳檢測其純度和完整性，超微量紫外分光光度計（購自安瑪西亞中國有限公司、型號：trospec 2100 pro）測定其濃度。

1.3 引物設(shè)計與合成 參照GenBank 提供的山羊Myf5基因（登錄號為NC_030812.1）、Myf6 基因（登錄號為NC_030812.1）基因序列和內(nèi)參基因三磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）的序列（登錄號：U390915），利用在線軟件Primer-BLAST 設(shè)計Myf5 跨外顯子1 和2 的熒光引物、Myf6 跨外顯子1 和2 的熒光引物。由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司對相關(guān)引物（表1）進(jìn)行合成。

表1 熒光定量目的基因引物的相關(guān)信息

1.4 實時熒光定量PCR 反應(yīng)

1.4.1 cDNA 第一鏈的合成 按照HiFiScript cDNA 第一鏈合成試劑盒說明書對提取的各組織總RNA 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA。逆轉(zhuǎn)錄總體積為20 μL：dNTP Mix（2.5 mmol/L Each） 4 μL，Primer Mix 2 μL，RNA Template 4 μL，5×RT Buffer 4 μL，DTT（0.1 mol/L）2 μL，HiFiScript（200 U/μL）1 μL，RNase-Free Water 3 μL。逆轉(zhuǎn)錄條件：42℃，60 min；75℃，5 min。將獲得的cDNA 瞬時離心后于冰上冷卻，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 熒光定量PCR 反應(yīng)體系 熒光定量PCR 反應(yīng)體系（20 μL）：（TransStart Tip Green qPCR SuperMix）SY BRMixture 10 μL，上、下游引物（10 pmol/μL）各 0.5 μL，cDNA（200 ng/μL）1 μL，dd H2O 8 μL。熒光定量PCR擴增程序：95℃預(yù)變性30s，95℃變性5 s；57℃退火15 s；72℃延伸10 s，40 個循環(huán)，每個組織樣品及內(nèi)參基因各設(shè)置3 孔重復(fù)。反應(yīng)結(jié)束后，以GAPDH 為內(nèi)參基因，Ct 值采用2-ΔΔCt法[10]計 算Myf5、Myf6 基因在同齡 黔北麻羊和努黔F1代不同組織的差異表達(dá)量。

1.4.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 選取心臟組織的cDNA 為標(biāo)準(zhǔn)樣品，按照1×10-2～1×10-6的梯度稀釋濃度，每個梯度濃度在熒光定量PCR 儀上進(jìn)行3 次重復(fù)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5 統(tǒng)計分析 實驗數(shù)據(jù)利用SPSS 19.0 統(tǒng)計處理軟件進(jìn)行單因素方差分析，用F 檢驗進(jìn)行各組間差異檢驗，顯著者再用Duncan′s 法進(jìn)行多重比較，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（n=3）表示，顯著水平均為P＜0.05。

2 結(jié) 果

2.1 RNA 提取結(jié)果檢測 超微量分光光度計定量對各組織部位樣品的總RNA 濃度和質(zhì)量進(jìn)行測定，所有樣品總RNA 的OD260/OD280值均在1.8～2.0，說明提取的總RNA 純度較高。利用瓊脂糖凝膠電泳對所提取的總RNA 質(zhì)量進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)28S、18S、5S rRNA 條帶清晰明亮（圖1），無明顯降解現(xiàn)象，說明提取的總RNA可以用于后續(xù)的反轉(zhuǎn)錄及實時熒光定量PCR。

圖1 不同組織的總RNA 電泳檢測結(jié)果

2.2 Myf5 基因、Myf6 基因RT-PCR 擴增產(chǎn)物檢測 以黔北麻羊和努黔F1代公羊不同組織c DNA 為模板，用已設(shè)計的引物分別對Myf5 基因、Myf6 基因和GAPDH基因進(jìn)行普通PCR 擴增，擴增產(chǎn)物用1 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測，分別獲得大小約140、120、149 bp 的條帶，與預(yù)期目的片段大小基本相符（圖2）。

2.3 Myf5、Myf6 基因在黔北麻羊和努黔F1代不同組織間相對表達(dá)分析 由圖3 可知， GAPDH、Myf5、Myf6 基因的擴增效率均在1 附近，相關(guān)系數(shù)R2皆大于0.993（理想擴增效率為0.8～1.2），擴增效率基本一致，可用于后續(xù)實時熒光定量分析；三者的熔解曲線均呈現(xiàn)單峰，表明引物特異性良好，沒有非特異性擴增產(chǎn)物和引物二聚體污染，可用于后續(xù)實驗。

由圖4 和圖5 可知，Myf5、Myf6 基因的表達(dá)在不同品種間總體無差異性，而在黔北麻羊和努黔F1代公羊的不同組織部位中均有不同程度的表達(dá)。Myf5 基因在黔北麻羊臂三頭肌、股二頭肌和背最長肌中的相對表達(dá)量極顯著高于心臟、腎臟、肝臟、脾臟、肺臟（P＜0.01），腎臟的相對表達(dá)量顯著高于肺臟和脾臟（P＜0.05）；Myf5 基因在黔北麻羊和努黔F1代臂三頭肌、股二頭肌和背最長肌中的相對表達(dá)量極顯著高于心臟、肝臟、腎臟、脾臟、肺臟（P＜0.01），肝臟的相對表達(dá)量顯著高于脾臟（P＜0.05）。Myf6 基因在黔北麻羊在臂三頭肌、股二頭肌和背最長肌中的相對表達(dá)量極顯著高于心臟、腎臟、肝臟、脾臟、肺臟（P＜0.01），心臟和肝臟的相對表達(dá)量均顯著高于脾臟（P＜0.05）；Myf6 基因在努黔F1代在股二頭肌和背最長肌中的相對表達(dá)量極顯著高于心臟、肝臟、腎臟、脾臟、肺臟（P＜0.01），心臟和肝臟的相對表達(dá)量顯著高于肺臟（P＜0.05）。

圖2 3 種基因PCR 擴增圖

圖3 3 種基因的擴增曲線、熔解曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖4 Myf5 基因在黔北麻羊和努黔F1 代各組織mRNA 的相對表達(dá)量

圖5 Myf6 基因在黔北麻羊和努黔F1 代各組織部位mRNA 的相對表達(dá)量

3 討 論

國內(nèi)外相關(guān)研究表明，Myf5、Myf6 基因表達(dá)于多種組織，在肌肉組織中表達(dá)量較高。目前，對Myf5、Myf6基因的研究多集中在分子結(jié)構(gòu)、多態(tài)性變異、病理、機理或者胚胎階段的表達(dá)以及不同羊品種間的表達(dá)研究[11-15]。而在黔北麻羊不同組織間的表達(dá)研究較少，尤其在肌肉組織表達(dá)尚未有相關(guān)研究報道。Zammit 等[16]研究發(fā)現(xiàn)，Myf5 在影響肌肉成熟和引導(dǎo)衛(wèi)星細(xì)胞功能再生骨骼肌的過程中起著重要作用，影響肌肉再生肌生成的遺傳控制。曹輝龍等[17]研究發(fā)現(xiàn)，Myf5 在南江黃羊不同肌肉組織（半腱肌、半膜肌、背最長肌、股四頭肌和臀中肌）中均有不同程度的表達(dá)。Myf5 基因均在京海黃雞[18]、鴨[19]胸肌和腿肌組織中高表達(dá)。在草魚紅肌、白肌、肝臟、胰臟、腎臟、腦和腸中均檢測到Myf5 基因的表達(dá)，紅肌和白肌組織中Myf5 基因mRNA 的表達(dá)量顯著高于其他組織[20]。

本研究結(jié)果表明，Myf5、Myf6 基因在黔北麻羊和努黔F1代公羊8 種組織中均有表達(dá)，這說明Myf5、Myf6 基因在黔北麻羊和努黔F1代中是廣譜表達(dá)基因，與在五指山豬的心臟、肝臟、肺臟、脾臟、腎臟、胃、小腸和肌肉等組織中均能夠檢測到該基因表達(dá)的[21]結(jié)果一致。程海星[22]研究表明，Myf6 基因在羊臂三頭肌和股二頭肌中不同程度表達(dá)，且與羊肉品質(zhì)有一定關(guān)聯(lián)。本實驗證實，Myf5、Myf6 基因在背最長肌和股二頭肌中表達(dá)量最高，與Myf5、Myf6 基因在巴美肉羊和蘇尼特羊的背最長肌、臂三頭肌、股二頭肌中均有不同程度表達(dá)，且不同月齡間各組織間表達(dá)量存在差異[23]的結(jié)果相近。

4 結(jié) 論

本研究表明，Myf5、Myf6 基因在12 月齡的黔北麻羊和努黔F1代公羊兩品種間各組織的表達(dá)差異不顯著；Myf5、Myf6 基因在黔北麻羊和努黔F1代公羊的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、背最長肌、股二頭肌和臂三頭肌各組織中均有表達(dá)，且不同組織部位中表達(dá)存在差異性；在背最長肌、股二頭肌和臂三頭肌組織中的表達(dá)量遠(yuǎn)高于心臟、肝臟、脾臟、肺臟和腎臟中的表達(dá)量。