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        基于DNA 池重測序技術(shù)的肉兔HSFs 基因多態(tài)性分析

        2019-05-27 03:00:38李叢艷梅秀麗鄺良德郭志強張翠霞謝曉紅
        中國畜牧雜志 2019年5期

        李叢艷,梅秀麗,鄺良德,李 娟,雷 岷,郭志強,張翠霞,謝曉紅*

        (1.四川省畜牧科學(xué)研究院,四川成都 610066;2.動物遺傳育種四川省重點實驗室,四川成都 610066;3.成都市農(nóng)林科學(xué)院畜牧研究所,四川成都 611130)

        熱休克因子(Heat Shock Factor,HSFs)是調(diào)控?zé)嵝菘说鞍祝℉eat Shock Protein,HSFs)最重要的轉(zhuǎn)錄因子,它通過與HSPs 基因啟動子區(qū)的熱休克元件(HSE)結(jié)合,啟動基因的轉(zhuǎn)錄,促進HSPs 的表達[1]。不同的熱休克因子在不同組織中表達,其結(jié)構(gòu)很相似,但功能上有著不同程度的差異。HSF1 是動物體內(nèi)最具代表性也是最重要的HSFs,在進化中高度保守并存在于各個物種中,在熱應(yīng)激反應(yīng)誘導(dǎo)HSFs 的表達中發(fā)揮著重要作用[2-3]。研究發(fā)現(xiàn)HSF1 上多個SNPs 位點與牛的耐熱性有關(guān)[4-7]。HSF4通過剪切變異體促進或抑制HSPs 的表達,從而調(diào)控?zé)嵝菘朔磻?yīng)的動態(tài)平衡[8],其他HSFs(HSF2、HSF3、HSF5)具有物種特異性,針對不同的組織或在不同條件下激活[9-12]。

        肉兔全身被毛且汗腺較少,夏季高溫時非常容易出現(xiàn)熱應(yīng)激,嚴重影響其生長速度、繁殖性能以及抗病力等[13],因此培育在高溫環(huán)境條件下仍能維持高生產(chǎn)水平的抗熱應(yīng)激肉兔群體是育種者的長期目標(biāo)。四川白兔和閩西南黑兔是在我國(中)亞熱帶氣候下長期選擇形成的地方品種,對高溫高濕環(huán)境具有自然耐受性;齊興肉兔含有四川白兔血緣,耐熱性較好;齊卡巨型兔為引進的大型肉兔品種,耐熱性差;加利福尼亞兔為中型肉兔品種,耐熱性能優(yōu)于齊卡巨型兔。本研究以上述5 個耐熱性能差異較大肉兔品種(系)為對象,采用DNA混池重測序和直接測序技術(shù),對HSF1 和HSF4 基因進行多態(tài)性檢測和群體遺傳學(xué)分析,以期為篩選耐熱相關(guān)分子標(biāo)記、開展耐熱肉兔品種培育提供參考。

        1 材料與方法

        1.1 實驗動物 實驗選擇齊卡巨型兔、齊興肉兔、加利福尼亞兔、四川白兔以及閩西南黑兔各30 只(公、母各半),共計150 個個體,采集5 g 左右耳組織樣品,置于裝有干冰的采樣箱帶回實驗室,-20℃冰箱凍存?zhèn)溆谩F渲旋R卡巨型兔、齊興肉兔以及加利福尼亞兔來源于四川省畜牧科學(xué)研究院種兔場,四川白兔來源于國家級四川白兔保種場成都鼎鑫兔業(yè)有限責(zé)任公司種兔場,閩西南黑兔來源于安岳晨陽兔業(yè)有限公司。

        1.2 基因組DNA 提取 按照動物組織樣DNA 提取試劑盒說明書提取樣品中的DNA,1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后利用紫外分光光度計測量其OD 值,根據(jù)測量的濃度將樣本稀釋到50~100 ng/μL,-20℃保存以進行下一步實驗操作。

        1.3 DNA 池重測序篩選SNPs 以齊卡巨型兔、齊興肉兔以及加利福尼亞兔為實驗對象,運用DNA 混池重測序技術(shù)篩選SNPs,每個品種選擇10 個樣本進行混池。測序深度為30,篩選的SNP 位點測序深度大于40。通過與NCBI 上家兔基因組對比,定位HSF1 和HSF4 基因序列,分析SNPs 位點,選擇錯義突變位點重新設(shè)計引物進行基因分型。

        1.4 引物設(shè)計 根據(jù)篩選獲得的HSF1 和HSF4 基因突變位置,以及GenBank 中提供的家兔HSF1(基因登錄號:NW_003160976.1)和HSF4(基因登錄號:NC_013673.1)基因序列,利用Primer Premier 5 設(shè)計特異性引物,送至上海生工生物工程股份有限公司合成。由于HSF1 上篩選出的3 個SNPs 位點間距離較短,因此設(shè)計1 對引物進行擴增,引物信息見表1。

        1.5 PCR 擴增 PCR 反應(yīng)體系(20 μL):DNA 模板(50 ng/μL)1 μL,上、下游引物(10 μmol/μL)各1 μL,2×Taq Master Mix(1.5 mmol/L)10 μL,ddH2O 7 μL。PCR 反應(yīng)擴增程序:95℃預(yù)變性5 min;95℃變性30 s,退火30 s,72℃延伸1 min,循環(huán)35 次;72℃延伸7 min,4℃保存。110 V條件下,用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 擴增產(chǎn)物,電泳30 min。

        1.6 測序 利用ABI 3730XL 測序儀采用雙脫氧鏈末端終止法對5 個群體150 個個體的PCR 擴增結(jié)果直接進行測序,根據(jù)測序結(jié)果進行個體基因分型。

        1.7 統(tǒng)計分析 基因型頻率和基因頻率采用基因直接計數(shù)法計算;有效等位基因數(shù)(Ne)、基因雜合度(He)、基因純合度(Ho)和多態(tài)信息含量(PIC)以及Hardy-Weinberg 平衡狀態(tài)的檢驗采用PopGene 軟件進行分析;應(yīng)用Haploview 軟件進行連鎖不平衡(LD)和單倍型分析;不同群體的基因(型)和單倍型(組合)分布采用SPSS 17.0 進行χ2檢驗。

        2 結(jié) 果

        2.1 SNPs 的確定 3 個DNA 池重測序結(jié)果(表2)發(fā)現(xiàn),HSF1 基因及其上、下游序列有32 個單堿基突變位點和8 個插入/缺失突變位點,其中有2 個單堿基突變及1 個插入/缺失位點位于基因外顯子區(qū),導(dǎo)致了錯義突變;HSF4 基因及其上、下游序列有11 個單堿基突變位點和3 個插入/缺失突變位點,其中有1 個單堿基突變位于外顯子上,引起錯義突變。

        2.2 PCR 產(chǎn)物測序 個體的PCR 產(chǎn)物測序結(jié)果見圖1。150 個個體中檢測到3 個SNPs 位點,分別為SNP1、SNP2 以及SNP4。SNP3 為假陽性SNP 位點,在群體中未發(fā)現(xiàn)多態(tài),均為正常CCT 序列(正常序列為連續(xù)4 個CCT,缺失序列為連續(xù)3 個CCT),未出現(xiàn)缺失(表2,圖1)。

        2.3 HSFs 基因的遺傳多態(tài)性分析 HSFs 基因的遺傳多態(tài)性分型結(jié)果見表3~4。3 個SNPs 位點的基因型和基因分布在5 個群體中均存在顯著(P<0.05)或極顯著差異(P<0.01),SNP1 在群體的基因型頻率與耐熱性高低呈現(xiàn)互相對應(yīng)關(guān)系,而SNP2 和SNP4 無明顯規(guī)律可循。地方品種四川白兔和閩西南黑兔在SNP1 中無多態(tài),均為GG 純合體,在SNP2 和SNP4 中均呈現(xiàn)中度多態(tài)(0.25<PIC<0.5),且為哈- 溫平衡群體(P>0.05)。齊興肉兔和加利福尼亞兔含有全部3 個SNPs,均呈中度多態(tài)(0.25<PIC<0.5),除齊興肉兔在SNP1、SNP2中表現(xiàn)為哈- 溫不平衡群體外(P<0.05),其余均表現(xiàn)為哈- 溫平衡群體(P>0.05),2 個群體在SNP1 優(yōu)勢基因型為GG,齊興肉兔的GG 型頻率高于加利福尼亞兔。齊卡巨型兔在3 個SNPs 上均表現(xiàn)中度多態(tài)性(0.25<PIC<0.5),且為哈- 溫平衡群體(P>0.05),其在SNP1 上的優(yōu)勢基因型為GA。

        表1 PCR 擴增引物序列

        表2 DNA 池重測序結(jié)果重要SNPs 信息

        圖1 SNPs 測序結(jié)果

        表3 5 個肉兔品種(系)HSFs 基因的基因型頻率和基因頻率

        2.4 連鎖不平衡和單倍型分析 利用Haploview 軟件進行連鎖不平衡分析(表5,圖2),結(jié)果表明,SNP1 與SNP2 處于完全連鎖不平衡(complete LD)(LOD=12.87,D'=1,r2=0.201),2 個多態(tài)位點共組成了CG、CA、TG 3 種單倍型;SNP1 與SNP4(LOD=1.23,D'=0.403,r2=0.028)以及SNP2 與SNP4 間(LOD=0.03,D'=0.032,r2=0.001)連鎖的可能性極小。

        表4 5 個肉兔品種(系)HSFs 基因的多態(tài)性分析

        表5 肉兔HSFs 基因的連鎖不平衡

        圖2 單倍型塊圖

        對5 個肉兔群體構(gòu)建單倍型,共得到3 種單倍型(表6)。在地方品種四川白兔和閩西南黑兔中只存在H1 和H3 2 種單倍型,優(yōu)勢單倍型均為H3;齊卡巨型兔中包含所有單倍型,其優(yōu)勢單倍型為H2;齊興肉兔和加利福尼亞兔中包含所有3 種單倍型,其優(yōu)勢單倍型均為H3。

        表6 單倍型統(tǒng)計分析

        3 討 論

        本研究利用DNA 池重測序技術(shù)檢測HSF1 和HSF4 的重要SNPs 位點,結(jié)果在2 個基因及其上、下游共檢出54 個SNPs,選擇其中4 個錯義突變位點進行一代測序分型,發(fā)現(xiàn)其中3 個SNPs 表現(xiàn)出預(yù)期多態(tài),而SNP3(缺失突變)并未表現(xiàn)出預(yù)期多態(tài),推測該位點可能是一個假陽性SNP。趙冰茹等[14]采用DNA 混池重測序時也發(fā)現(xiàn)細毛羊LAMB1 基因10 個錯義突變中有3 個假陽性SNPs,推測可能是由于重測序技術(shù)的堿基偏好性使得個別SNP 測序時的覆蓋率不高,或由于二代測序讀長較短,進而造成后續(xù)序列拼接、組裝等生物信息學(xué)分析困難。因此,盡管DNA 池重測序篩查的SNP 位點的準(zhǔn)確性較高,但仍需要采用其他方法進行驗證。

        HSF1 是HSFs 家族中最重要的一員。Hong 等[3]研究發(fā)現(xiàn),在溫度不斷升高的條件下,哺乳動物細胞通過激活HSF1 使HSFs 表達量增加,充分表明了HSF1在動物的熱應(yīng)激反應(yīng)中具有重要作用。有鑒于此,國內(nèi)外多個研究者對HSF1 基因與耐熱的關(guān)系進行了研究,發(fā)現(xiàn)其與牛的耐熱性有關(guān)。Li 等[6-7]發(fā)現(xiàn),HSF1基因的T909C 和G4693T 突變及其構(gòu)建的單倍型與中國荷斯坦奶牛的耐熱性能有關(guān),4 年后Li 等[15]在3′-UTR 區(qū)域新發(fā)現(xiàn)1 個SNP 位點,并進一步證實了之前變異位點是重要的耐熱性分子標(biāo)記;王延久等[5]發(fā)現(xiàn),HSF1 基因第3 內(nèi)含子中存在1 個多態(tài)位點,在耐熱性能不佳的荷斯坦奶牛、耐熱性能好的魯西黃牛和渤海黑牛的群體中分布差異較大,推測其可能與耐熱性有關(guān);Baena 等[4]也發(fā)現(xiàn),HSF1 上的多態(tài)位點與安格斯牛的耐熱性有關(guān)。本研究在家兔HSF1 基因外顯子8 上發(fā)現(xiàn)的SNP1 和SNP2 均造成了氨基酸突變,且位于該基因4 個可變剪切體的共有序列內(nèi),單倍型分析發(fā)現(xiàn)它們呈完全連鎖狀態(tài)(D'=1)。5 個群體在SNP1 上的GG 基因型頻率大小及耐熱性能均表現(xiàn)為四川白兔= 閩西南黑兔>齊興肉兔>加利福尼亞兔>齊卡巨型兔,說明SNP1 的GG 基因型可能對兔耐熱性的形成有積極作用,是重要的耐熱性候選分子標(biāo)記,與上述研究結(jié)論一致。SNP2 在5 個群體的優(yōu)勢基因型分布并無規(guī)律,因此推測該位點的變異可能與肉兔的耐熱性無關(guān)。單倍型分析發(fā)現(xiàn),四川白兔、閩西南黑兔以及耐熱性次之的齊興肉兔和加利福尼亞兔的優(yōu)勢單倍型均為H3,而耐熱性差的齊卡巨型兔的優(yōu)勢單倍型為H2,與前面單個SNPs多態(tài)分析的結(jié)果相符,推測單倍型H3 可能是肉兔耐熱性的優(yōu)勢單倍型。

        HSF4 在HSFs 中發(fā)現(xiàn)較晚,Tanabe 等[8]研究結(jié)果表明,HSF4 通過可變剪接形成HSF4a 和HSF4b 剪切體,通過抑制和激活熱休克蛋白的表達,參與熱應(yīng)激的調(diào)節(jié)。此外,HSF4 參與晶狀體的正常發(fā)育,該基因突變是白內(nèi)障產(chǎn)生的重要原因[16-18]。本研究選擇HSF4 作為肉兔耐熱的候選基因,發(fā)現(xiàn)5 個肉兔群體在HSF4 上基因型分布和基因分布與品種間的耐熱性能高低并無規(guī)律的對應(yīng)關(guān)系,推測該位點可能與肉兔的耐熱性無關(guān)。

        4 結(jié) 論

        本研究表明,肉兔HSF1 基因中SNP1 的基因型GG 及單倍型H3 可能與肉兔的耐熱性有關(guān)。下一步應(yīng)檢測不同基因(單倍)型個體間HSF1 基因表達量是否存在顯著差異,以對本實驗結(jié)果的可靠性進行驗證,為在生產(chǎn)上應(yīng)用該分子標(biāo)記開展耐熱肉兔新品種培育提供依據(jù)。

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