朱思怡，呂國(guó)榮，陳秋月

(1.福建醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院超聲科，福建 泉州 362000；2.泉州醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，母嬰健康服務(wù)應(yīng)用技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心，福建 泉州 362000)

早產(chǎn)兒肺表面活性物質(zhì)(pulmonary surfactant，PS)缺乏，常發(fā)生肺損傷，導(dǎo)致新生兒呼吸窘迫綜合征等疾病，是早產(chǎn)兒夭折的首要原因[1]。目前常用的PS氣管內(nèi)給藥及產(chǎn)前地塞米松預(yù)防早產(chǎn)兒肺損傷的策略均存在各種不良反應(yīng)，對(duì)其安全性存在爭(zhēng)議[2-3]。有學(xué)者[4-5]嘗試使用超聲引導(dǎo)羊膜腔內(nèi)注射PS預(yù)防早產(chǎn)兒肺損傷，取得一定效果。本研究探討超聲引導(dǎo)羊膜腔內(nèi)注射PS聯(lián)合產(chǎn)前應(yīng)用氨溴索預(yù)防早產(chǎn)兔肺損傷的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康妊娠新西蘭兔20只，體質(zhì)量3.5～5.0 kg，平均(4.29±0.38)kg，購(gòu)自上海市松江區(qū)松聯(lián)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物場(chǎng)，許可證號(hào)：SCXK(滬)2012-0011。于新西蘭兔妊娠第18～21天轉(zhuǎn)移至泉州醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(閩)2016-0001。將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為產(chǎn)前應(yīng)用鹽酸氨溴索(ambroxol hydrochloride，AH)組(AH組)、超聲引導(dǎo)羊膜腔內(nèi)注射PS組(PS組)、超聲引導(dǎo)羊膜腔內(nèi)注射PS聯(lián)合產(chǎn)前應(yīng)用AH組(PS+AH組)和對(duì)照組，每組5只。

1.2 儀器與主要試劑 采用Hitachi Preirus彩色多普勒超聲診斷儀；一次性消毒介入穿刺針(22 G，150 mm)；豬肺磷脂注射液，主要成分二棕櫚酰磷脂酰膽堿(dipalmitoyl phosphatidylcholine，DPPC)；AH注射液等。

1.3 方法 AH組和PS+AH組于妊娠第24～26天連續(xù)3天每日經(jīng)孕兔耳緣靜脈注射AH注射液75 mg/kg體質(zhì)量。PS組和PS+AH組于妊娠第27天行超聲引導(dǎo)羊膜腔穿刺術(shù)：經(jīng)耳緣靜脈注射2%異戊巴比妥鈉1.25 ml/kg體質(zhì)量，確認(rèn)孕兔角膜反射消失后，以仰臥位保定于動(dòng)物專用手術(shù)板，于腹部備皮、消毒、鋪巾；行腹部超聲檢查確定最佳穿刺部位及進(jìn)針路線，探頭適當(dāng)加壓并固定，以一次性介入穿刺針行羊膜腔穿刺術(shù)，分別向每個(gè)羊膜囊注射豬肺磷脂注射液0.1 ml(圖1)；對(duì)照組于妊娠第24～26天每日經(jīng)孕兔耳緣靜脈注射生理鹽水10 ml/kg體質(zhì)量，并于妊娠第27天行超聲引導(dǎo)羊膜腔穿刺術(shù)，手術(shù)過(guò)程同PS組和PS+AH組，但向羊膜囊內(nèi)注入生理鹽水0.1 ml。對(duì)4組均于妊娠第27天羊膜腔穿刺后1 h行剖宮產(chǎn)術(shù)，取出早產(chǎn)兔。

圖1 超聲引導(dǎo)妊娠新西蘭兔羊膜腔穿刺術(shù) 箭示穿刺針

每窩隨機(jī)抽選2只早產(chǎn)兔，觀察其存活時(shí)間。剖出早產(chǎn)兔30 min后，每窩另隨機(jī)抽取2只行支氣管肺泡灌洗，檢測(cè)灌洗液中白細(xì)胞介素6(interleukin-6，IL-6)和DPPC含量。剪取其余早產(chǎn)兔右肺下葉，制備肺組織切片，進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，測(cè)定去除背景光密度后陽(yáng)性細(xì)胞的平均光密度(mean optical density，MOD)值，以檢測(cè)肺表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白A(pulmonary surfactant-associated proteins-A，SP-A)表達(dá)水平；進(jìn)行HE染色觀察早產(chǎn)兔肺組織病理?yè)p傷程度，并參考Ge等[6]提出的肺損傷病理評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)肺泡水腫程度、肺泡腔內(nèi)紅細(xì)胞漏出程度、肺不張程度和氣道黏膜上皮細(xì)胞脫落程度對(duì)肺組織切片進(jìn)行評(píng)分。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)分析軟件。符合正態(tài)分布及方差齊性的計(jì)量資料以±s表示，4組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法；對(duì)不符合正態(tài)分布及方差齊性的資料采用中位數(shù)(上下四分位數(shù))表示，4組間比較采用Kruskal-WallisH檢驗(yàn)，兩兩比較采用Nemenyi檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 存活時(shí)間 4組早產(chǎn)兔間存活時(shí)間總體差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001，表1)。PS組、AH組及PS+AH組早產(chǎn)兔存活時(shí)間均較對(duì)照組延長(zhǎng)(P均<0.05)，但3組間早產(chǎn)兔存活時(shí)間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。

2.2 實(shí)驗(yàn)室檢查 4組早產(chǎn)兔間肺泡灌洗液中IL-6及DPPC含量總體差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.001，表1)。組間兩兩比較，PS組、AH組、PS+AH組與對(duì)照組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)，PS+AH組早產(chǎn)兔肺泡灌洗液中IL-6含量較PS組、AH組減少，DPPC含量較PS組、AH組增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)，PS組與AH組間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。

2.3 肺組織SP-A表達(dá)水平 4組早產(chǎn)兔間肺組織MOD值總體差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001，表1)，對(duì)照組MOD值最低，與其余3組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)，PS+AH組肺組織MOD值高于PS組與AH組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)，PS組與AH組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.4 肺損傷病理改變 PS組早產(chǎn)兔肺泡結(jié)構(gòu)完整，充分?jǐn)U張且擴(kuò)張均勻；肺泡腔多清晰，其內(nèi)少見(jiàn)滲出物或漏出的紅細(xì)胞；氣道上皮多完整、連續(xù)(圖2A)。AH組肺泡結(jié)構(gòu)完整，充分?jǐn)U張且擴(kuò)張均勻，擴(kuò)張程度與PS組基本相同；肺泡腔多清晰，其內(nèi)滲出物或漏出的紅細(xì)胞少見(jiàn)；氣道上皮多完整、連續(xù)(圖2B)。PS+AH組肺泡結(jié)構(gòu)完整，充分?jǐn)U張且擴(kuò)張均勻，擴(kuò)張程度較PS組、AH組更大；肺泡腔清晰，其內(nèi)未見(jiàn)明顯滲出物或漏出的紅細(xì)胞；氣道上皮多完整、連續(xù)(圖2C)。對(duì)照組肺泡廣泛塌陷，部分表現(xiàn)為充氣不均勻，同時(shí)局部區(qū)域肺泡擴(kuò)張過(guò)度、部分肺泡間隔斷裂、相互融合成為更大囊腔；肺泡腔內(nèi)水腫液、滲出物及紅細(xì)胞多見(jiàn)；氣道上皮斷裂、脫落、壞死多見(jiàn)(圖2D)。

4組早產(chǎn)兔間肺組織損傷程度病理評(píng)分總體差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001，表1)。其中，對(duì)照組病理評(píng)分最高，與其余3組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)；PS+AH組低于PS組和AH組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)，而PS組與AH組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3 討論

早產(chǎn)兒指妊娠滿28周至不足37周間分娩出的新生兒，由于其肺發(fā)育不成熟，自身合成的PS不足，肺泡表面張力增加，肺順應(yīng)性下降，氣體交換嚴(yán)重受限，常導(dǎo)致患兒發(fā)生代謝性酸中毒及低氧血癥，繼而肺血管痙攣，血管內(nèi)皮受損，刺激以IL-6為主的多種促炎細(xì)胞因子釋放增多，進(jìn)而導(dǎo)致肺損傷[7]。

PS羊膜腔內(nèi)給藥的理論基礎(chǔ)是羊水內(nèi)物質(zhì)能夠進(jìn)入胎肺。Galan等[8]將PS與右旋糖酐鐵混合后注入孕兔的羊膜腔內(nèi)，其后于剖宮產(chǎn)取出的早產(chǎn)兔肺內(nèi)和氣道遠(yuǎn)端發(fā)現(xiàn)均勻分布的鐵微粒，表明經(jīng)羊膜腔內(nèi)注入的PS可進(jìn)入胎兔肺內(nèi)，推測(cè)其機(jī)制可能為胎兔在宮內(nèi)即具有表淺而規(guī)律的呼吸樣運(yùn)動(dòng)，能夠吸入羊水，從而使注入羊膜腔中的PS順利進(jìn)入胎兔的呼吸道。

表1 4組早產(chǎn)兔存活時(shí)間、實(shí)驗(yàn)室檢查及病理指標(biāo)比較

注：*：與對(duì)照組比較，P<0.05；#：與PS+AH組比較，P<0.05

圖2 早產(chǎn)兔肺組織病理圖(HE，×400) A.PS組肺泡結(jié)構(gòu)完整，擴(kuò)張充分、均勻，肺泡腔清晰；B.AH組肺泡結(jié)構(gòu)完整，擴(kuò)張充分、均勻，與PS組擴(kuò)張程度相仿，肺泡腔清晰；C.PS+AH組肺泡結(jié)構(gòu)完整，擴(kuò)張充分、均勻，擴(kuò)張程度較PS組、AH組更大，肺泡腔清晰；D.對(duì)照組肺泡萎陷

應(yīng)用于母體的氨溴索能夠通過(guò)胎盤屏障，對(duì)胎肺組織特異性較高，可上調(diào)胎肺內(nèi)源性PS合成，促進(jìn)胎肺發(fā)育成熟、預(yù)防早產(chǎn)兒肺損傷。氨溴索發(fā)揮肺保護(hù)作用的其他可能機(jī)制[9-11]如下：①特異性抑制肺泡巨噬細(xì)胞溶酶體內(nèi)磷脂酶A的活性，減少胎肺內(nèi)磷脂分解，使PS含量增多；②上調(diào)水通道蛋白表達(dá)以減輕肺水腫；③發(fā)揮抗氧化作用減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)；④減少促炎細(xì)胞因子產(chǎn)生。

本研究中對(duì)照組早產(chǎn)兔存活時(shí)間短于接受產(chǎn)前干預(yù)措施的PS組、AH組和PS+AH組，且其肺泡灌洗液中IL-6含量明顯升高，病理學(xué)檢查顯示該組早產(chǎn)兔肺泡萎陷，肺組織形態(tài)學(xué)上呈損傷改變，肺損傷病理評(píng)分亦顯著高于其他3組，提示早產(chǎn)肺損傷動(dòng)物模型建立成功。

PS是由Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞合成并分泌的生物活性物質(zhì)，可降低肺泡表面張力，穩(wěn)定肺泡內(nèi)壓，避免呼氣末肺泡塌陷[12]。PS由脂類和蛋白質(zhì)組成，脂類中以DPPC含量最多，也是PS發(fā)揮功能的主要有效成分；SP-A為Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞中含量最多的肺表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白(pulmonary surfactant-associated proteins，SP)亞型，其含量約占SP總量的1/2，具有穩(wěn)定PS形態(tài)、調(diào)控炎癥反應(yīng)等多種重要生理功能[13]。因此，本研究檢測(cè)DPPC和SP-A含量，一方面可驗(yàn)證早產(chǎn)兔PS水平，檢測(cè)胎肺發(fā)育情況，另一方面也可作為判斷肺損傷的指標(biāo)。

本研究中，PS組、AH組及PS+AH組早產(chǎn)兔支氣管肺泡灌洗液中的DPPC及SP-A表達(dá)水平均較對(duì)照組明顯增高(P均<0.05)，與Liu等[14]的研究結(jié)果一致，提示超聲引導(dǎo)羊膜腔內(nèi)注射PS和產(chǎn)前應(yīng)用氨溴索均可有效增加早產(chǎn)兔肺組織中PS含量；進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，在3個(gè)產(chǎn)前干預(yù)組中，PS+AH組早產(chǎn)兔肺內(nèi)DPPC及SP-A表達(dá)水平均高于PS組和AH組(P均<0.05)，推測(cè)聯(lián)合使用超聲引導(dǎo)羊膜腔內(nèi)注射PS和產(chǎn)前應(yīng)用氨溴索可分別從內(nèi)源性和外源性兩個(gè)方面增加PS含量，能更有效地預(yù)防早產(chǎn)兔肺損傷。

綜上所述，超聲引導(dǎo)羊膜腔內(nèi)注射PS及產(chǎn)前應(yīng)用氨溴索均能有效發(fā)揮預(yù)防早產(chǎn)兔肺損傷的作用，聯(lián)合應(yīng)用此2種產(chǎn)前干預(yù)手段預(yù)防早產(chǎn)兔肺損傷的效果優(yōu)于單獨(dú)應(yīng)用。