張衛(wèi)林，曹禮庭，蔣冰蕾*，熊云濤

(1.德陽市人民醫(yī)院超聲科，四川 德陽 618000；2.川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院超聲科，四川 南充 637000；3.四川省醫(yī)學影像學重點實驗室，四川 南充 637000；4.四川省科學城醫(yī)院超聲科，四川 綿陽 621900)

骨骼肌缺血再灌注損傷(skeletal muscle ischemia-reperfusion injury，SMIRI)是指各種原因使骨骼肌短時間缺血缺氧后血供恢復而引起的劇烈炎癥反應(yīng)，可導致機體發(fā)生生理、生化、免疫等一系列改變。SMIRI常致肌肉活力降低甚至喪失，及時切除失活肌肉對預(yù)防感染及其他嚴重并發(fā)癥意義重大，但切除過多肌肉不利于患肢功能恢復。早期評估肌肉活力，對治療SMIRI和改善預(yù)后均有重要意義。本研究探討CEUS參數(shù)評估兔下肢骨骼肌缺血再灌注后肌肉活力的可行性。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選取健康清潔級新西蘭兔22只，雌雄不限，體質(zhì)量2.0～2.5 kg，由川北醫(yī)學院動物實驗中心提供(動物許可證號：SCXK川2013-18)。本研究經(jīng)川北醫(yī)學院動物倫理委員會批準。

1.2 SMIRI模型建立 采用肌注速眠新Ⅱ進行麻醉誘導，劑量為0.1 ml/kg體質(zhì)量，待角膜反射消失后隨機選擇一側(cè)耳緣及下肢備皮，建立耳緣靜脈通道；30 min后肌注3%戊巴比妥鈉(1.0 ml/kg體質(zhì)量)維持麻醉；將5個橡膠圈捆綁于備皮下肢膝關(guān)節(jié)，觸摸脛前動脈搏動消失、針刺足底未見明顯出血認為血流阻斷，5 h后去掉橡膠圈。

1.3 儀器與方法 采用Philips iU22超聲儀，L9-3線陣探頭，探頭頻率3～9 MHz。首先對兔患側(cè)小腿行常規(guī)超聲掃查，設(shè)定機械指數(shù)為0.07，啟動脈沖反向諧波影像(pulse inversion harmonic imaging，PIH)，進入CEUS模式。經(jīng)耳緣靜脈團注造影劑聲諾維(0.1 ml/kg體質(zhì)量)[1]，并以5 ml 0.9%生理鹽水迅速沖注。分別采集造模前(T0)及去掉橡膠圈(再灌注)即刻(T1)、1 h(T2)、2 h(T3)、4 h(T4)患側(cè)小腿常規(guī)超聲和CEUS圖像(圖1)。將圖像導入Qlab軟件，于腓骨側(cè)皮下1 cm處(大體病理示受累最嚴重區(qū))勾畫ROI(5 mm×5 mm)，繪制時間-強度曲線(time-intensity curve，TIC)，計算絕對峰值強度(absolute peak intensity,API)、峰值強度(peak intensity，PI)、達峰時間(time to peak，TTP)、升支斜率(ascending slope，AS)、降支斜率(descending slope，DS)、始增時間(arrival time，AT)、降支減半時間(half time of descending，HT)及50%清除率(PI/HT×50%)。

1.4 組織病理學檢查 對所有實驗兔分別于T0、T1、T2、T3時在造影部位腓骨側(cè)皮下1 cm處穿刺取患側(cè)肌肉組織，行常規(guī)HE染色。于T4時造影后處死實驗兔，分別在肌肉穿刺部位取約5 mm×5 mm×5 mm組織塊，經(jīng)固定、脫水等處理后行常規(guī)HE染色。由2名具有15年以上工作經(jīng)驗的病理科主任及副主任醫(yī)師在不知曉實驗設(shè)計的情況下閱片，分別對肌細胞完整性、肌間隙寬度、炎細胞浸潤程度等做出評價，意見不同時經(jīng)協(xié)商達成一致。根據(jù)損傷最嚴重區(qū)域肌肉大體及病理學表現(xiàn)“4C”征[2]將實驗兔分為有肌肉活力組及無肌肉活力組。

1.5 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 22.0統(tǒng)計分析軟件。符合正態(tài)分布的計量資料以±s表示。2組間各時間點API、PI、TTP、AS、DS、AT、HT及50%清除率比較采用兩獨立樣本t檢驗；同組各時間點比較采用方差分析，各時間點兩兩比較采用LSD檢驗。采用ROC曲線分析API對肌肉活力的診斷效能。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

22只實驗兔中，2只麻醉過程中心跳、呼吸驟停；2只顯影失敗(1只造影劑外漏、1只靜脈通道建立失敗)，最終納入18只實驗兔。18只實驗兔患側(cè)小腿均較健側(cè)小腿顏色暗淡，肌肉腫脹、飽滿，張力增高，韌性稍差，均以小腿腓骨側(cè)(中上份后比目魚肌及周圍肌群)損傷最明顯。最終將10只歸入有肌肉活力組，8只歸入無肌肉活力組。有肌肉活力組肌肉為紅色，夾持或電刺激見肌肉收縮，肌肉韌性正常，邊緣有出血點；無肌肉活力組肌肉呈褐色或黑褐色，夾持或電刺激其收縮減弱甚至消失，韌性降低或消失，邊緣無出血或滲出極慢。

2.1 CEUS參數(shù) 有肌肉活力組T1及T4時API均大于無肌肉活力組(P均<0.05)，其余指標同一時間點2組間比較差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。有肌肉活力組內(nèi)各時間點API、PI、TTP差異有統(tǒng)計學意義(P均<0.01)；T1、T2、T3、T4時API均較T0時降低，T4時PI較T0時降低，T3時TTP較T0時升高(均P<0.05)。無肌肉活力組內(nèi)各時間點API、PI、AT差異有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)，T4時API、PI均較T0時降低，AT較T0時升高(P均<0.05)。見表1。

2.2 診斷效能 ROC曲線結(jié)果顯示，T1時API(截斷值為6.93 dB)評估骨骼肌缺血再灌注后肌肉活力的敏感度為100%，特異度為60%，AUC為0.85[95%CI(0.67,1.00)，P<0.05]；T4時API(截斷值為4.25 dB)的敏感度為100%，特異度為70%，AUC為0.89[95%CI(0.75,1.00)，P<0.05]。

表1 2組兔骨骼肌缺血再灌注后各時間點CEUS相關(guān)參數(shù)比較(±s)

表1 2組兔骨骼肌缺血再灌注后各時間點CEUS相關(guān)參數(shù)比較(±s)

組別API(dB)PI(dB)TTP(s)ASDSAT(s)HT(s)50%清除率有肌肉活力組(n=10) T010.09±3.8714.98±5.2216.61±3.601.06±0.33-0.13±0.1910.87±3.6615.15±5.640.56±0.30 T17.66±2.95#14.11±4.5117.66±3.460.98±0.39-0.09±0.0410.53±3.7720.33±13.480.45±0.21 T26.50±3.07#12.67±3.9220.32±5.170.91±0.48-0.10±0.0510.55±2.9218.75±13.240.50±0.33 T35.06±2.09#11.58±3.3821.97±4.26#0.80±0.53-0.09±0.0412.80±3.5317.00±12.300.47±0.27 T44.90±2.09#10.74±4.25#20.77±3.710.73±0.43-0.33±0.3413.84±3.3112.28±7.030.54±0.27 F值21.649.235.022.850.453.931.850.28 P值<0.01<0.01<0.010.060.580.070.160.69無肌肉活力組(n=8) T06.59±4.3013.32±3.0618.75±2.670.83±0.41-0.07±0.0412.46±2.4318.44±13.690.51±0.32 T13.85±1.51?11.30±4.4920.34±3.430.57±0.31-0.06±0.0314.63±3.2517.86±12.530.82±1.41 T24.27±2.4810.50±3.5121.01±3.970.80±0.34-0.09±0.0315.70±3.7514.69±10.630.49±0.28 T33.39±2.4911.01±2.4621.31±7.400.57±0.46-0.13±0.1715.00±5.2311.74±11.000.78±0.43 T42.07±1.06?#9.76±3.78#23.33±5.220.55±0.27-0.24±0.2716.59±6.78#14.36±9.020.49±0.36 F值14.666.991.072.660.603.321.290.65 P值<0.01<0.010.410.120.450.040.290.64

注：*：與有肌肉活力組同時間點比較，P<0.05；#：與同組T0時比較，P<0.05

圖1 2組兔骨骼肌缺血再灌注后不同時間點聲像圖 A.有肌肉活力組T0；B.無肌肉活力組T0；C.有肌肉活力組T1；D.無肌肉活力組T1；E.有肌肉活力組T4；F.無肌肉活力組T4；與T0(A、B)時相比，T1(C、D)、T4(E、F)時肌組織增厚明顯，回聲局灶性增強、減弱并存，部分組織間隙積液，而2組間同時點比較未見顯著差異

2.3 病理表現(xiàn) 與T0、T1時比較，T2、T3時肌細胞稍腫脹，細胞間隙略增寬，肌原纖維溶解、斷裂增多，部分肌細胞見多個“篩網(wǎng)狀”圓形空泡；與T2、T3時比較，T4時肌原纖維溶解、斷裂更明顯，部分肌間隙出現(xiàn)中性粒細胞。無肌肉活力組上述組織病理學變化均較有肌肉活力組更顯著(圖2)。

3 討論

臨床上SMIRI常見于四肢，亦可累及非毗鄰器官或組織[3]，甚至引發(fā)彌漫性血管內(nèi)凝血(disseminated intravascular coagulation，DIC)及多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)等，病因包括止血帶使用時間過長、動脈損傷、急性栓塞等。SMIRI發(fā)病率約13/100 000～17/100 000，但死亡率高達21%[4]。目前主要采用檢測肌肉損傷程度評估局部SMIRI[5]。近紅外光譜測定是評估肌肉微循環(huán)的有效工具，但其可穿透深度小于 3 cm；2,3,5-氯化三苯基四氮唑和氮藍四唑染色法[6]可用于測定肌肉活力，但為有創(chuàng)性檢查。本研究以新西蘭兔為研究對象，制備SMIRI模型，采用CEUS動態(tài)觀察患側(cè)骨骼肌肌肉活力，探討CEUS參數(shù)用于早期無創(chuàng)評價SMIRI實驗兔肌肉活力的可行性。

既往研究[7]報道，缺血6 h幾乎整個肌群均將受累，故本研究將實驗兔下肢缺血時間設(shè)定為5 h。大體病理示缺血再灌注側(cè)小腿均較健側(cè)小腿顏色暗淡、肌肉腫脹、張力增高、韌性差，提示造模成功。根據(jù)損傷最嚴重區(qū)域肌肉“4C”征[2]，實驗兔分有肌肉活力組及無肌肉活力組，相同條件下2組表現(xiàn)不同可能與實驗兔對缺血敏感性、耐受性及損傷修復機制存在差異有關(guān)。本研究通過分別采集2組造模前(T0)及再灌注后不同時間點患側(cè)小腿聲像圖，獲得CEUS相關(guān)參數(shù)，結(jié)果顯示2組內(nèi)各時間點API、PI差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.01)，且病理結(jié)果顯示，隨再灌注時間延長，2組病理損傷表現(xiàn)均加重，無肌肉活力組較有肌肉活力組損傷更嚴重，提示CEUS參數(shù)可能反映缺血再灌注后肌肉損傷情況，有肌肉活力組T1及T4時API均大于無肌肉活力組(P均<0.05)。API表示TIC內(nèi)PI與基礎(chǔ)強度的差異，可反映病變組織血供情況。與有肌肉活力組相比，無肌肉活力組血供減少、能量降低，導致其神經(jīng)-體液依賴性血管舒張減弱[8]，毛細血管灌注差，加之存在無復流現(xiàn)象，肌肉組織早期即出現(xiàn)缺血壞死，致API顯著減小[9]，且隨再灌注時間延長損傷持續(xù)加重，API呈減小趨勢。T1時無肌肉活力組API較有肌肉活力組明顯降低，提示API對早期區(qū)分肌肉活力有重要參考價值。進一步行ROC曲線分析結(jié)果顯示，T1、T4時API均可用于評估骨骼肌缺血再灌注后肌肉活力(AUC分別為0.85、0.89，P均<0.05)，可作為缺血再灌注后肌肉活力的評價指標。除API外，本研究中2組間其余參數(shù)同一時間點比較差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)，但樣本量少，有待加大樣本量再行分析。

綜上所述，CEUS參數(shù)可反映骨骼肌缺血再灌注后肌肉活力，其中API可作為兔缺血再灌注后肌肉活力的評價指標。