謝 琦，陳惠嫻，杜 磊，廖炎輝，譚智霖，楊逸銘，吳敏儀，黃偉玲，，張鼎旋，

(1.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬?gòu)V州市第一人民醫(yī)院南沙醫(yī)院醫(yī)學(xué)影像科，廣東 廣州 511457；2.華南理工大學(xué)附屬第二醫(yī)院南沙醫(yī)院醫(yī)學(xué)影像科，廣東 廣州 511457；3.廣東省中醫(yī)院醫(yī)學(xué)影像科，廣東 廣州 510030；4.番禺中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)影像科，廣東 廣州 511400)

多數(shù)結(jié)腸癌患者診斷時(shí)已是中晚期，一般以5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU)化療為主，化療過(guò)程中腫瘤細(xì)胞易出現(xiàn)對(duì)化療藥物的耐受[1]，患者無(wú)進(jìn)展生存期僅8.7～12.3個(gè)月。目前主要通過(guò)體外檢測(cè)腫瘤標(biāo)記物監(jiān)測(cè)腫瘤細(xì)胞耐藥性，亟待尋找影像學(xué)方法活體監(jiān)測(cè)腫瘤細(xì)胞耐藥性。體素內(nèi)不相干運(yùn)動(dòng)(intravoxel incoherent motion，IVIM)成像可提供與組織生理特性、細(xì)胞和細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的相關(guān)信息，如細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)、微結(jié)構(gòu)和微循環(huán)[2]。本研究探討IVIM活體檢測(cè)結(jié)腸癌小鼠對(duì)5-FU耐藥性的可能。

1 材料與方法

1.1 人類結(jié)腸癌耐藥細(xì)胞株的建立 將人類結(jié)腸癌SW480親代細(xì)胞株(購(gòu)自中山大學(xué)動(dòng)物中心細(xì)胞庫(kù))培養(yǎng)于37℃完全新鮮培養(yǎng)液、5% CO2孵箱中，細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，換為含6 μg/ml 5-FU的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，再換為無(wú)5-FU的完全培養(yǎng)液培養(yǎng)，1～2天換液1次，待細(xì)胞重新恢復(fù)正常增殖、生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)傳代，再以含此濃度5-FU的培養(yǎng)液沖擊培養(yǎng)誘導(dǎo)耐藥細(xì)胞株，交替培養(yǎng)6個(gè)月，獲得可在6 μg/ml 5-FU濃度中穩(wěn)定生長(zhǎng)的人類結(jié)腸癌SW480耐藥細(xì)胞株，即SW480/5-FU。

MTT比色法檢測(cè)人類結(jié)腸癌親本SW480、耐藥SW480/5-FU細(xì)胞半抑制濃度(50% inhibitory concentration，IC50)，計(jì)算耐藥指數(shù) (resistance index,RI)：RI=SW480/5-FU IC50/SW480 IC50。

1.2 荷瘤鼠模型制備 選取10只健康BALB/c裸小鼠(購(gòu)自中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，雌性，5～6周齡，體質(zhì)量約16～18 g。將其分為耐藥組(n=5)和不耐藥組(n=5)，分別于其雙側(cè)大腿根部皮下注入SW480/5-FU和SW480細(xì)胞懸液(0.2 ml/側(cè)，細(xì)胞濃度4×107/ml)，定期觀察腫瘤生長(zhǎng)情況，待腫瘤生長(zhǎng)至最長(zhǎng)徑1.50 cm以上行MR檢查。

1.3 MR檢查 采用Siemens Magnetom Skyra 3.0T MR系統(tǒng)，上海辰光8通道相控陣鼠標(biāo)式鼠線圈。腹腔麻醉荷瘤鼠后以俯臥位保定進(jìn)行MR掃描：T2W快速自旋回波(turbo spin echo,TSE)序列，TR 4 500 ms，TE 110 ms，層厚2 mm，層間隔0，F(xiàn)OV 128 mm×128 mm，NAS 4，采集矩陣128×128，重建矩陣512×512，行軸位(圖1A)、冠狀位(圖1B)、矢狀位成像，掃描時(shí)間2 min 2 s；T1W TSE序列，TR 2 780 ms，TE 15 ms，層厚2 mm，間隔0，F(xiàn)OV 200 mm×200 mm，NAS 2，采集矩陣200×200，重建矩陣768×768，行冠狀位成像(圖1C)，掃描時(shí)間1 min 46 s；DWI采用EPI序列，軸位，TR 3 400 ms，TE 60 ms，按各向同性施加擴(kuò)散敏感梯度場(chǎng)，取8個(gè)b值(0、50、100、150、200、400、800、1 200 s/mm2)。FOV 220 mm×220 mm，NAS 3，層厚2 mm，采集矩陣220×220，重建矩陣308×308，掃描時(shí)間13 min 39 s。

圖1 荷瘤鼠MR成像 A.軸位T2WI;B.冠狀位T2WI;C.冠狀位T1WI

由2名放射科醫(yī)師以盲法對(duì)多b值DWI圖像進(jìn)行分析，意見不同則經(jīng)協(xié)商達(dá)成一致。將多b值DWI數(shù)據(jù)導(dǎo)入MITK Diffusion Version 2013.03.00軟件，在腫瘤最大切面實(shí)性區(qū)域選擇3個(gè)ROI，避開出血、囊變及壞死區(qū)域，記錄真擴(kuò)散系數(shù)(true-diffusion coefficient,D)、假擴(kuò)散系數(shù)(pseudo-diffusion coefficient,D*)、灌注分?jǐn)?shù)(perfusion fraction,f)，并取均值。

1.4 細(xì)胞學(xué)檢測(cè) MR檢查結(jié)束后經(jīng)腹腔注射10%水合氯醛處死荷瘤鼠，完整取出腫瘤放入冰生理鹽水。將腫瘤分為2份。1份放入4%多聚甲醛溶液固定，用于HE染色并采用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end labeling，TUNEL)法檢測(cè)細(xì)胞凋亡：由2名病理科醫(yī)師分別按相同標(biāo)準(zhǔn)在偏光顯微鏡下分析病理切片，凋亡細(xì)胞為細(xì)胞核呈棕黃色，隨機(jī)選取5個(gè)高倍(×400)視野觀察，計(jì)算TUNEL凋亡細(xì)胞與細(xì)胞總數(shù)的百分比，即細(xì)胞凋亡指數(shù)(apoptosis index,AI)，取2名醫(yī)師的均值。另1份放入液氮，行Western Blot檢測(cè)P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)、多藥耐藥相關(guān)蛋白1(multidrug resistance-associated protein 1,MRP1)、蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)表達(dá)。采用凝膠圖象處理系統(tǒng)Image J分析條帶的凈光密度值，計(jì)算蛋白表達(dá)光密度比(relative integrated optical density,RIOD)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件。計(jì)量資料以±s表示，2組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)，以Spearman分析觀察IVIM參數(shù)與腫瘤細(xì)胞蛋白表達(dá)的相關(guān)性。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

耐藥組SW480/5-FU細(xì)胞IC50為20.59 μg/ml，不耐藥組SW480細(xì)胞IC50為4.64 μg/ml，RI=4.44。

不耐藥組腫瘤D值較耐藥組增加(P=0.008)，2組腫瘤D*值、f值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)，見表1。

表1 耐藥組與不耐藥組腫瘤D值、D*值、f值比較(±s，n=5)

表1 耐藥組與不耐藥組腫瘤D值、D*值、f值比較(±s，n=5)

組別D(×10-3 mm2/s)D?(×10-3 mm2/s)f(%)耐藥組0.63±0.052.81±0.925.58±1.55不耐藥組0.95±0.185.20±2.367.59±3.47Z值2.6111.7760.940P值0.0080.0950.421

HE染色示2組腫瘤壞死區(qū)域范圍相似；耐藥組細(xì)胞核較不耐藥組增大，且細(xì)胞間排列更緊密，細(xì)胞密度較大(圖2)。TUNEL法發(fā)現(xiàn)2組均可見散在的細(xì)胞核呈棕黃染色的凋亡細(xì)胞(圖3)，耐藥組和不耐藥組AI分別為(38.24±5.58)%、(31.42±10.31)%，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-1.091，P=0.275)。耐藥組P-gp、MRP1、PKC表達(dá)量均較不耐藥組增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)，見表2。

表2 耐藥組與不耐藥組蛋白表達(dá)RIOD值比較(±s，n=5)

表2 耐藥組與不耐藥組蛋白表達(dá)RIOD值比較(±s，n=5)

組別P-gpMRP1PKC不耐藥組0.20±0.03 0.15±0.010.16±0.02 耐藥組0.31±0.080.69±0.100.86±0.06Z值2.6112.7852.668P值0.0030.0050.008

腫瘤D值與P-gp(rs=-0.697，P=0.025)、MRP1(rs=-0.925，P<0.001)、PKC(rs=-0.693，P=0.026)表達(dá)均呈負(fù)相關(guān)。

3 討論

目前腫瘤耐藥性監(jiān)測(cè)多采用體外實(shí)驗(yàn)[3]。但腫瘤組織是分化不均勻的異質(zhì)性和多形性細(xì)胞群體，體外實(shí)驗(yàn)僅能檢測(cè)活檢區(qū)域腫瘤組織的耐藥情況，不能準(zhǔn)確反映其整體耐藥性；且體外檢測(cè)只有取得腫瘤標(biāo)本才可進(jìn)行，為有創(chuàng)檢查，所需時(shí)間較長(zhǎng)，腫瘤組織離體后某些代謝物含量會(huì)產(chǎn)生改變，最終可能影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。因此，探索一種便捷、可靠的方法以活體評(píng)價(jià)整個(gè)腫瘤的耐藥性有重要價(jià)值。

圖2 病理圖(HE，×400) A.不耐藥組;B.耐藥組 耐藥組W480/5-FU細(xì)胞核較SW480增大，且細(xì)胞間排列更緊密

圖3 腫瘤組織細(xì)胞凋亡檢測(cè)(TUNEL法，×400) A.不耐藥組;B.耐藥組 2組均發(fā)現(xiàn)散在細(xì)胞核呈棕黃染色的凋亡細(xì)胞

DWI可無(wú)創(chuàng)進(jìn)行微觀水平活體成像，準(zhǔn)確、快速顯示空間結(jié)構(gòu)和組織成分。組織中水分子擴(kuò)散能力與組織細(xì)胞密度和細(xì)胞膜完整性呈負(fù)相關(guān)，細(xì)胞膜不完整或細(xì)胞間隙增大時(shí)，水分子運(yùn)動(dòng)受限程度減低，DWI信號(hào)增高[2]。ADC能量化分析可反映活體組織中水分子擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)受限程度，及組織構(gòu)成、功能狀態(tài)與微觀結(jié)構(gòu)等變化[4]。本課題組前期研究[5]結(jié)果顯示，與不耐藥組移植瘤對(duì)比，耐藥組移植瘤ADC值降低(P>0.05)，提示當(dāng)腫瘤產(chǎn)生耐藥時(shí)，其生物學(xué)性狀的差異可能導(dǎo)致以上表征改變，并通過(guò)水分子交換功能的改變而體現(xiàn)。另外，組織內(nèi)水分子擴(kuò)散還受微循環(huán)血液灌注等因素影響，而傳統(tǒng)DWI忽略了局部毛細(xì)血管網(wǎng)的微循環(huán)灌注對(duì)ADC值的影響[4-6]。

IVIM模型通過(guò)分析多b值DWI圖像而對(duì)水分子擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)與微循環(huán)血液灌注[2]單獨(dú)量化，獲得擴(kuò)散相關(guān)參數(shù)D值和灌注相關(guān)參數(shù)D*、f值。D值反映水分子在組織中的流動(dòng)性,取決于細(xì)胞與細(xì)胞外空間的曲折度、細(xì)胞膜的完整性和流體的黏度[7-10]；D*值反映體素內(nèi)微循環(huán)灌注相關(guān)的擴(kuò)散效應(yīng)，取決于血流速度和微血管段的長(zhǎng)度[11-13]。f為體素內(nèi)微循環(huán)相關(guān)的灌注效應(yīng)占總體擴(kuò)散效應(yīng)容積的比值，是微血管血流對(duì)DWI信號(hào)的相對(duì)變化[2,4]。因此，IVIM評(píng)價(jià)腫瘤耐藥性更具有潛在價(jià)值。

IVIM可不受微循環(huán)灌注等因素影響而反映相對(duì)客觀可信的水分子擴(kuò)散狀態(tài)。擴(kuò)散系數(shù)主要取決于細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外的空間組織比，D值一般被認(rèn)為與細(xì)胞密度呈負(fù)相關(guān)[2,4,6]。有研究[14]顯示化療后鼻咽癌病灶D值增加，可能是由于化療藥物殺傷腫瘤細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)胞密度減少所致。本研究不耐藥組移植瘤D值較耐藥組增高(P<0.05)，且與腫瘤耐藥相關(guān)蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)；腫瘤組學(xué)研究顯示2組腫瘤細(xì)胞的壞死、凋亡無(wú)顯著差別，但耐藥組細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則、組織間隙較不耐藥組小，核漿比較不耐藥組增大。推測(cè)這是由于親本SW480結(jié)腸癌在5-FU反復(fù)刺激下腫瘤細(xì)胞生物學(xué)性狀發(fā)生改變，增殖能力增強(qiáng)，細(xì)胞核增大，成瘤后細(xì)胞密度增加、胞外間隙變窄，導(dǎo)致腫瘤水分子擴(kuò)散能力減弱，D值降低。細(xì)胞密度增大可導(dǎo)致腫瘤血管形成受阻，最終導(dǎo)致腫瘤缺血壞死和酸中毒，致使對(duì)化療藥物不敏感；且由于腫瘤血管缺乏化療藥物到達(dá)瘤體的“通道”，使瘤內(nèi)藥物濃度較低。以上機(jī)制均可能與腫瘤多藥耐藥相關(guān)[15]。

D*值與平均血流速度和平均毛細(xì)血管段長(zhǎng)度呈正比，而f值較高則提示腫瘤血供較為豐富。血管量也可對(duì)腫瘤耐藥性產(chǎn)生影響，理論上血供較多的腫瘤出現(xiàn)缺氧壞死和酸中毒的概率較低，且化療藥物濃度也與腫瘤血供呈正相關(guān)。但Koh等[16]發(fā)現(xiàn)鼻咽癌放化療有效組及無(wú)效組間f值和D*值差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。Hauser等[14]則發(fā)現(xiàn)鼻咽癌f值越高，對(duì)化療藥物越不敏感，預(yù)后反而較差。Che等[17]觀察乳腺癌輔助化療患者，敏感組f值低于非敏感組(P<0.05)，2組D*值差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。本研究耐藥組和不耐藥組f值和D*值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，可能由于IVIM成像尚不能反映腫瘤組織毛細(xì)血管特性和血流動(dòng)力學(xué)的變化。此外，本研究顯示移植瘤表面可見一層纖維包膜覆蓋，可能對(duì)腫瘤血管生長(zhǎng)與侵入起阻礙作用，不能完全模擬原位腫瘤的血供特點(diǎn)，這也可能降低了通過(guò)f值和D*檢測(cè)腫瘤耐藥的敏感度。

總之，與不耐藥組裸鼠人類結(jié)腸移植瘤相比，耐藥組D值降低，并與腫瘤耐藥蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，提示D值可能成為活體檢測(cè)腫瘤耐藥性的分子標(biāo)記物。