孫 全,徐 沖,劉 霞,郭小紅,李 杰,冷 靜
(重慶市中醫(yī)院藥劑科,重慶 400021)
烏梅為薔薇科植物梅Prunus mume(Sieb.)Sieb.Et Zucc的干燥近成熟果實(shí),具有斂肺、澀腸、生津、安蛔之功效,藥用歷史悠久,始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,列為中品,常用于肺虛久咳,久瀉久痢,虛熱消渴,蛔厥嘔吐、腹痛等[1]?!督饏T玉函經(jīng)》《備急千金要方》《外臺(tái)秘要》《普濟(jì)方》均提及烏梅炮制方法,有醋泡、醋蒸、醋煮等。2015年版《中國(guó)藥典(一部)》收載的烏梅及其飲片包括烏梅[2-3]、烏梅肉[4]、烏梅炭[5-6]。目前關(guān)于烏梅及不同炮制品指紋圖譜的比較研究少見報(bào)道。本研究中采用指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)與化學(xué)識(shí)別模式相結(jié)合的方式[7-14]綜合分析烏梅不同炮制品的質(zhì)量,為其質(zhì)量控制和臨床應(yīng)用提供參考。
1260型高效液相色譜儀(安捷倫科技有限公司);XA205DU型天平(十萬分之一,梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易有限公司);AS10200AT型超聲波清洗器(天津奧特賽恩斯儀器有限公司)。
烏梅(四川新荷花中藥飲片股份有限公司,批號(hào)為D1506073),經(jīng)重慶市中醫(yī)院藥劑科副主任中藥師陳玲鑒定為正品,符合2015年版《中國(guó)藥典(一部)》烏梅項(xiàng)下的規(guī)定。
取烏梅藥材100 g,加入米醋200 mL,浸泡12 h,干燥,得醋烏梅。取烏梅肉,預(yù)熱炒藥鍋至100℃時(shí)投入烏梅肉100 g,并待鍋溫升至235℃時(shí)開始計(jì)時(shí),控制此溫度不變,共炒制8 min,迅速出鍋,熄滅火星,攤涼即得烏梅炭[15]。取烏梅藥材 100 g,加醋 45 mL,拌勻,分別隔水蒸2,3,4 h,干燥,得不同蒸制時(shí)間的醋蒸制烏梅樣品。
采用不同的提取溶劑(30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇、100%甲醇)進(jìn)行超聲處理,將提取液進(jìn)行液相分析,30%甲醇提取液的色譜峰較多,故選擇30%甲醇作為烏梅各種炮制樣品的提取溶劑。
通過紫外全波長(zhǎng)掃描,烏梅提取液在215,288,314 nm波長(zhǎng)處有最大吸收,分別將215,288,314 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)對(duì)烏梅進(jìn)行分析,烏梅提取液在215 nm波長(zhǎng)處的基線較平穩(wěn),色譜峰較多,故選215 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。
取烏梅不同炮制品樣品1 g,精密稱定,加入50 mL 30%甲醇,稱定質(zhì)量,超聲提取1 h,用30%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量,提取液用0.45 μm微孔濾膜過濾,作為供試品溶液。
色譜柱:PhenomenexC18柱(250mm×4.6mm,5μm);檢測(cè)波長(zhǎng):215 nm;流速:0.6 mL /min;柱溫:25 ℃;流動(dòng)相:甲醇(A)-0.2%磷酸溶液(B),梯度洗脫(見表 1)。
表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序
精密度試驗(yàn):取同一供試品溶液,精密稱定,連續(xù)進(jìn)樣6次。結(jié)果各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.31%(n=6),相對(duì)峰面積的RSD為 2.36% (n=6),表明儀器精密度良好。
重復(fù)性試驗(yàn):取樣品粉末共6份,每份約1 g,按2.1項(xiàng)下方法制備供試品溶液,分別進(jìn)樣。結(jié)果各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.80%(n=6),相對(duì)峰面積的RSD為3.67%(n=6)。表明該方法重復(fù)性良好。
穩(wěn)定性試驗(yàn):取同一供試品溶液,分別于0,4,8,12,24 h時(shí)進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD為 0.24% (n=5),相對(duì)峰面積的RSD為 2.95%(n=5),表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。
分別稱取烏梅不同炮制品樣品,按2.4項(xiàng)下方法制備供試品溶液。取各供試品溶液,按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定,記錄65 min的色譜圖,導(dǎo)出烏梅不同炮制品色譜圖的AIA格式文件,采用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012版)進(jìn)行分析。
用中位數(shù)法建立對(duì)照指紋圖譜,并進(jìn)行多點(diǎn)校正及色譜峰的匹配,共標(biāo)定25個(gè)共有峰,各樣品選定共有峰的峰面積總和均大于50%,相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于1%。根據(jù)相似度評(píng)價(jià)結(jié)果,烏梅、醋烏梅、醋蒸制烏梅與對(duì)照指紋圖譜的相似度均較高;烏梅炭與對(duì)照指紋圖譜的相似度均較低。結(jié)果見圖1,表2和表3。
圖1 烏梅不同炮制品高效液相色譜特征指紋圖譜及共有模式
表2 烏梅及不同炮制品共有峰峰面積及相對(duì)峰面積
表3 烏梅及不同炮制品HPLC特征指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)結(jié)果
以烏梅不同炮制品的HPLC特征指紋圖譜共有峰的峰面積為變量,采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)原始數(shù)據(jù)作標(biāo)準(zhǔn)化處理后進(jìn)行主成分分析。以主成分的特征值及貢獻(xiàn)率為依據(jù)選擇主成分,結(jié)果見表4。前3個(gè)主成分特征值均大于1,累計(jì)貢獻(xiàn)率為92.468%,包含了大部分的信息。其中,主成分1的特征向量載荷較高且符號(hào)為正的共有峰相對(duì)保留時(shí)間(tR)分別為 5.252,6.579,10.542,16.831,22.910,47.367 min;主成分 2 的特征向量載荷較高且符號(hào)為正的共有峰的tR分別為5.053,5.629,9.608,22.910,50.961 min;主成分 3 的特征向量載荷較高且符號(hào)為正的共有峰tR分別為12.508,54.176,54.875 min。詳見圖 2。
表4 主成分特征值及貢獻(xiàn)率
圖2 三維載荷圖
以各樣品在主成分1、主成分2、主成分3中的得分繪制 3D 得分圖。由圖 3 可知,樣品 S1,S2,S4,S5,S6 距離較近,可分為一類。樣品S3可分為一類,主成分分析結(jié)果與相似度分析結(jié)果基本一致,進(jìn)一步驗(yàn)證了相似度分析的可靠性。
圖3 主成分3D得分圖
為得到峰形,分離度較好,色譜信息較豐富的HPLC指紋圖譜,本試驗(yàn)中對(duì)乙腈-水、乙腈-磷酸溶液、甲醇-水、甲酸-磷酸溶液等不同流動(dòng)相組成及流動(dòng)相比例進(jìn)行了梯度洗脫考察。并考察了不同測(cè)定波長(zhǎng)215,288,314 nm對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響。結(jié)果以 Phenomenex C18柱作為色譜柱,檢測(cè)波長(zhǎng)為215 nm,流速為0.6 mL /min,柱溫為 25 ℃ ,流動(dòng)相為甲醇(A)-0.2%磷酸溶液(B)梯度洗脫為能得到較好指紋圖譜信息。
相似度評(píng)價(jià)結(jié)果顯示,烏梅及醋炮制烏梅與對(duì)照指紋圖譜之間的相似度較高,均在0.950以上,烏梅炭與對(duì)照指紋圖譜的相似度較低。通過繪制主成分1、主成分2、主成分3的3D得分圖,烏梅與醋烏梅在3D散點(diǎn)圖中的空間距離較近,可劃分為一類,而烏梅炭與烏梅及醋烏梅相距較遠(yuǎn),分為一類。相似度的評(píng)價(jià)結(jié)果與主成分分析結(jié)果一致,表明炒炭過程造成烏梅化學(xué)成分的變化較大。
中藥炮制后可達(dá)到增強(qiáng)療效,降低毒副作用,改變或緩和藥性,引藥歸經(jīng)等作用。醋制可引藥入肝經(jīng),并有引藥入血及收斂等作用。由于烏梅醋制研究現(xiàn)狀的薄弱,臨床用藥時(shí)往往與炭炒發(fā)生混用。烏梅不同炮制品指紋圖譜結(jié)果顯示,烏梅及醋烏梅指紋圖譜信息既有共性又有差異,化學(xué)成分種類基本一致,但峰面積有所不同。烏梅炭與烏梅及醋烏梅化學(xué)成分及含量都有較大差異。本研究中通過指紋圖譜與化學(xué)識(shí)別模式相結(jié)合的方式評(píng)價(jià)烏梅及不同炮制品的質(zhì)量,可為其藥理作用的差異進(jìn)一步研究及臨床用藥提供一定的依據(jù)。