任 桐，朱鵬宇，楊洪濤

（天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，天津 300381）

腎間質(zhì)纖維化（RIF）屬于腎臟纖維化的一部分，是慢性腎臟?。–KD）進(jìn)展為終末期腎臟?。‥SRD）過(guò)程中重要的病理過(guò)程。在RIF發(fā)生的早期，凝血酶可通過(guò)激活腎間質(zhì)內(nèi)毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞表面蛋白酶激活受體（PAR-1），引起腎間質(zhì)內(nèi)毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生一系列趨化因子及黏附分子如單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）、細(xì)胞間黏附分子-1（ICAM-1）等，致使單核/巨噬細(xì)胞等炎癥反應(yīng)細(xì)胞向腎間質(zhì)遷移浸潤(rùn)，進(jìn)一步釋放轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（TGF-β1）等細(xì)胞因子，最終引起RIF。本實(shí)驗(yàn)從凝血酶這一角度入手，旨在探討水蛭素對(duì)腎間質(zhì)纖維化過(guò)程的干預(yù)機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性SD大鼠，體質(zhì)量（180±20）g，購(gòu)自北京華阜康生物科技有限公司。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 天然水蛭素凍干粉，購(gòu)自湖北武漢勝天宇生物科技有限公司；鹽酸貝那普利片，購(gòu)自北京諾華制藥有限公司。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 BX60顯微鏡，購(gòu)自O(shè)LYMPUS；Mini-PROTEAN 3電泳芯，購(gòu)自 Bio-Rad；FluorChem FC2 Imaging System，購(gòu)自 Alpha Innotech；Epgiadients PCR儀，購(gòu)自 Eppendorf；ABI 7500 fast熒光定量PCR儀，購(gòu)自Life Technologies。

1.1.4 實(shí)驗(yàn)試劑 10%甲醛溶液、二甲苯、系列乙醇、中性樹(shù)膠，購(gòu)自天津血液研究所病理科；牛血清白蛋白（BSA，V900933），購(gòu)自 Sigma-Aldrich；Allin-OneTMFirst-Strand cDNA Synthesis Kit（AORT-0060），購(gòu) 自 GeneCopoeia；Trizol（115596026）、Platinum?SYBR?Green qPCR SuperMix-UDG（C11733-046），購(gòu)自 invitrogen；蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒（G1120）、RIPA裂解緩沖液（R0010），購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；BCA蛋白定量分析試劑盒（NCI3225CH），購(gòu)自 Thermo Fisher；PVDF 膜（IPVH00010），購(gòu)自 Millipore；ECL（sc-2048），購(gòu)自Santa Cruz；兔抗大鼠MCP-1多克隆抗體（ab25124）、兔抗大鼠ICAM-1多克隆抗體（ab124760）、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG多克隆抗體（ab6721），購(gòu)自 abcam。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 分組方案 健康雄性SD大鼠120只，體質(zhì)量（180±20）g，隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、水蛭素高劑量組、水蛭素低劑量組、貝那普利組，每組各24只。1.2.2 大鼠UUO模型制備 對(duì)模型組、水蛭素高劑量組、水蛭素低劑量組、貝那普利組均建立大鼠UUO模型：大鼠經(jīng)腹腔注射10%水合氯醛溶液麻醉后固定，于下腹部正中位置切口1．5 cm，游離左側(cè)輸尿管并結(jié)扎切斷，使左腎完全梗阻。對(duì)假手術(shù)組僅游離左側(cè)輸尿管，不結(jié)扎切斷。術(shù)后每只大鼠均應(yīng)用20萬(wàn)單位青霉素注射行抗感染治療3 d。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)過(guò)程 術(shù)后第1天起，水蛭素高劑量組均給予水蛭素（84 U/kg，1次/日）皮下注射，水蛭素低劑量組均給予水蛭素（42 U/kg，1次/日）皮下注射，貝那普利組均給予鹽酸貝那普利片溶于生理鹽水后（2 mL，1次/日）灌胃，假手術(shù)組、模型組均給予生理鹽水（2 mL，1次/日）皮下注射。每組分別于術(shù)后第3、7、14天時(shí)，隨機(jī)選擇8只大鼠處死，取梗阻側(cè)腎組織，部分制作石蠟切片以備病理檢測(cè)，其余部分放入液氮保存并制作冰凍切片，以備逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）及蛋白免疫印跡（Western Blot）檢測(cè)。

1.2.4 病理檢測(cè) 用二甲苯、系列乙醇將石蠟切片脫蠟并水化；加入蘇木素染液，室溫下靜置20 min；自來(lái)水沖洗5 min；加入分化液，室溫下靜置30 s；浸入自來(lái)水15 min；加入伊紅染液2 min；自來(lái)水沖洗5 min；自來(lái)水浸泡5 min；脫水、透明、封片，鏡下觀察其腎小管等腎間質(zhì)結(jié)構(gòu)形態(tài)變化、淋巴細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)情況及纖維組織形態(tài)。

1.2.5 RT-PCR檢測(cè) 取出100 mg冰凍組織保存于Eppendorf管中；加入1 mLTrizol溶液，用電動(dòng)勻漿機(jī)進(jìn)行勻漿；室溫下靜置15 min；加入0．2 mL三氯甲烷，振蕩混勻；室溫下靜置10 min后，4℃下離心（12 000 r/min，10 min）；取上清液轉(zhuǎn)移至另一新Eppendorf管中；加入0．5 mL異丙醇，在室溫下靜置10 min 后，4 ℃下離心（12 000 r/min，10 min）；棄去上清液，用無(wú)水乙醇洗滌沉淀物2次，每次5 min，4℃下離心（8 000 r/min，10 min）；室溫下干燥；加入100μLDEPC水以重懸；按照試劑盒說(shuō)明書(shū)，用Allin-OneTMFirst-Strand cDNA Synthesis Kit進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，用Platinum?SYBR?Green qPCR SuperMix-UDG進(jìn)行擴(kuò)增；取擴(kuò)增產(chǎn)物5μL，瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果，用β-actin作參照，MCP-1、ICAM-1 相對(duì)表達(dá)水平采用 2-ΔΔCT公式計(jì)算[1]。

1.2.6 Western Blot檢測(cè) 采用Western Blot方法檢測(cè)腎組織中MCP-1、ICAM-1的表達(dá)。方法如下：取出冰凍組織，加入RIPA裂解緩沖液，冰上勻漿，4℃下離心（12 000 r/min，20 min）后保存于Eppendorf管中；取50μL裂解物，測(cè)定蛋白質(zhì)濃度；取等量蛋白質(zhì)及β-Actin進(jìn)行SDS-PAGE，100 V下電泳1 h；轉(zhuǎn)移至PVDF膜；加入含5%奶粉的TBST溶液室溫下靜置1 h；加入含5%奶粉的TBST溶液稀釋一抗，4℃下孵育過(guò)夜；用TBST沖洗PVDF膜3次，每次5 min；加入含5%奶粉的TBST溶液稀釋二抗，室溫下孵育1 h；用TBST沖洗PVDF膜3次，每次5 min；用TBS沖洗PVDF膜5 min；加入ECL，室溫下避光靜置10 min以顯色；曝光顯影。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)采用SPSS22．0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，數(shù)據(jù)多組間比較采用單因素方差分析（one-way Anova），組間兩兩比較采用 LSD 法，以 P＜0．05 認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HE染色結(jié)果 假手術(shù)組術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)未見(jiàn)明顯病理改變。模型組自術(shù)后第3天可見(jiàn)腎小管輕度擴(kuò)張，腎間質(zhì)輕度水腫，單核/巨噬細(xì)胞少量浸潤(rùn)；第7天可見(jiàn)腎小管進(jìn)一步擴(kuò)張，腎小管上皮細(xì)胞空泡變性，腎間質(zhì)內(nèi)單核/巨噬細(xì)胞等炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)增多，纖維組織輕度增生；第14天可見(jiàn)腎皮質(zhì)、髓質(zhì)變薄，腎小管結(jié)構(gòu)破壞，出現(xiàn)腎小管萎縮，基底膜部分消失，腎小管上皮細(xì)胞壞死，纖維組織明顯增生，腎間質(zhì)內(nèi)淋巴細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞大量浸潤(rùn)。與模型組相比：水蛭素高劑量組、水蛭素低劑量組、貝那普利組腎間質(zhì)損傷均有不同程度減輕。具體見(jiàn)圖1。

2.2 Western Blot檢測(cè)

2.2.1 MCP-1蛋白質(zhì)相對(duì)表達(dá)量 與假手術(shù)組相比：模型組各時(shí)間點(diǎn)及水蛭素低劑量組第3、7天MCP-1蛋白質(zhì)相對(duì)表達(dá)量顯著增加（P＜0．01）；水蛭素高劑量組、貝那普利組第3、7天及水蛭素低劑量組第14 天 MCP-1 蛋白質(zhì)相對(duì)表達(dá)量增加（P＜0．05）。與模型組相比，水蛭素高劑量組第14天MCP-1蛋白質(zhì)相對(duì)表達(dá)量顯著減少（P＜0．01）；水蛭素高劑量組第3、7天及貝那普利組第3、14天MCP-1蛋白質(zhì)相對(duì)表達(dá)量減少（P＜0．05）。具體見(jiàn)表 1。

圖1 HE染色結(jié)果（×200倍）Fig.1 HE staining results（× 200）

表1 MCP-1蛋白質(zhì)相對(duì)表達(dá)量（±s）Tab.1 Protein expression of MCP-1（±s）

表1 MCP-1蛋白質(zhì)相對(duì)表達(dá)量（±s）Tab.1 Protein expression of MCP-1（±s）

注：與假手術(shù)組相比，*P＜0．05，**P＜0．01；與模型組相比，#P＜0．05，##P＜0．01。

組別 第3天 第7天 第14天假手術(shù)組 0．50±0．03 0．48±0．03 0．53±0．04模型組 1．02±0．10** 0．92±0．10** 0．89±0．08**水蛭素高劑量組 0．67±0．04*# 0．66±0．05*# 0．51±0．04##水蛭素低劑量組 1．00±0．08** 0．84±0．08** 0．80±0．07*貝那普利組 0．79±0．05*# 0．80±0．07* 0．60±0．05#

2.2.2 ICAM-1蛋白質(zhì)相對(duì)表達(dá)量 與假手術(shù)組相比：模型組各時(shí)間點(diǎn)ICAM-1蛋白質(zhì)相對(duì)表達(dá)量均顯著增加（P＜0．01）；水蛭素低劑量組、貝那普利組各不同時(shí)間點(diǎn)ICAM-1蛋白質(zhì)相對(duì)表達(dá)量均增加（P＜0．05）。與模型組相比：水蛭素高劑量組第7天ICAM-1 蛋白質(zhì)相對(duì)表達(dá)量顯著減少（P＜0．01）；水蛭素高劑量組第3、14天及水蛭素低劑量組第14天、貝那普利組各不同時(shí)間點(diǎn)ICAM-1蛋白質(zhì)相對(duì)表達(dá)量均減少（P＜0．05）。具體見(jiàn)表 2。

2.3 RT-PCR檢測(cè)

2.3.1 MCP-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量 與假手術(shù)組相比：模型組各時(shí)間點(diǎn)、貝那普利組第3天MCP-1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量顯著升高（P＜0．01）；水蛭素高劑量組、水蛭素低劑量組各不同時(shí)間點(diǎn)及貝那普利組第 7、14天 MCP-1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量升高（P＜0．05）。與模型組相比：水蛭素高劑量組第7、14天MCP-1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量顯著降低（P＜0．01）；水蛭素高劑量組第3天及水蛭素低劑量組、貝那普利組各不同時(shí)間點(diǎn) MCP-1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量降低（P＜0．05）。具體見(jiàn)表3。

2.3.2 ICAM-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量 與假手術(shù)組相比：模型組各不同時(shí)間點(diǎn)ICAM-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量均顯著升高（P＜0．01）；水蛭素高劑量組、水蛭素低劑量組及貝那普利組ICAM-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量均升高（P＜0．05）。與模型組相比：水蛭素高劑量組、貝那普利組各不同時(shí)間點(diǎn)及水蛭素低劑量組第7、14天ICAM-1mRNA 相對(duì)表達(dá)量均降低（P＜0．05）。具體見(jiàn)表4。

表2 ICAM-1蛋白質(zhì)相對(duì)表達(dá)量（±s）Tab.2 Protein expression of ICAM-1（±s）

表2 ICAM-1蛋白質(zhì)相對(duì)表達(dá)量（±s）Tab.2 Protein expression of ICAM-1（±s）

注：與假手術(shù)組相比，*P＜0．05，**P＜0．01；與模型組相比，#P＜0．05，##P＜0．01。

組別 第3天 第7天 第14天假手術(shù)組 0．54±0．04 0．55±0．04 0．57±0．05模型組 1．00±0．09** 0．92±0．09** 0．99±0．09**水蛭素高劑量組 0．67±0．07# 0．51±0．05## 0．63±0．07#水蛭素低劑量組 0．88±0．08* 0．84±0．08* 0．82±0．07*#貝那普利組 0．76±0．71*# 0．71±0．06*# 0．80±0．07*#

表3 MCP-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量（±s）Tab.3 The mRNA expression of MCP-1（±s）

表3 MCP-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量（±s）Tab.3 The mRNA expression of MCP-1（±s）

注：與假手術(shù)組相比，*P＜0．05，**P＜0．01；與模型組相比，#P＜0．05，##P＜0．01。

組別 第3天 第7天 第14天假手術(shù)組 1．00 1．00 1．00模型組 1．87±0．31** 1．98±0．26** 2．10±0．33**水蛭素高劑量組 1．33±0．13*# 1．27±0．17*## 1．25±0．18*##水蛭素低劑量組 1．52±0．23*# 1．45±0．18*# 1．39±0．21*#貝那普利組 1．47±0．20**# 1．52±0．22*# 1．45±0．23*#

3 討論

作為CKD進(jìn)展為ESRD的主要病理過(guò)程，RIF一直是研究的熱點(diǎn)。目前，尚未發(fā)現(xiàn)能抑制甚至逆轉(zhuǎn)RIF過(guò)程的特效藥物。RIF的主要表現(xiàn)包括細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）增多與腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化（TEMT）。

CKD進(jìn)展至ESRD過(guò)程中，腎臟長(zhǎng)期處于缺血、缺氧狀態(tài)。有害內(nèi)環(huán)境可使氧自由基、細(xì)胞因子、內(nèi)毒素及凝血酶等濃度升高。其中，凝血酶能激活腎間質(zhì)毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞表面PAR-1，進(jìn)而激活多種信號(hào)通路，導(dǎo)致腎間質(zhì)毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞釋放大量細(xì)胞因子、黏附分子如MCP-1、ICAM-1等，引起一系列病理過(guò)程，如Grandaliano等[1]的研究表明PAR-1表達(dá)的增加與纖溶酶原激活物抑制劑-1（PAI-1）表達(dá)的減少能促進(jìn)RIF發(fā)生過(guò)程中ECM的蓄積；Mercer等[2]的研究證實(shí)在肺纖維化過(guò)程中PAR-1的激活能誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞釋放MCP-1增多，進(jìn)而從多種途徑引起肺纖維化；Rahman等[3]的研究證實(shí)PAR-1能激活毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）信號(hào)通路，從而促進(jìn) ICAM-1 轉(zhuǎn)錄。由上述研究可知PAR-1的激活能誘導(dǎo)細(xì)胞MCP-1、ICAM-1表達(dá)上調(diào)，這與對(duì)應(yīng)器官纖維化過(guò)程有著密切的聯(lián)系。

表4 ICAM-1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量（s）Tab.4 The mRNA expression of ICAM-1（±s）

表4 ICAM-1 mRNA 相對(duì)表達(dá)量（s）Tab.4 The mRNA expression of ICAM-1（±s）

注：與假手術(shù)組相比，*P＜0．05，**P＜0．01；與模型組相比，#P＜0．05。

組別 第3天 第7天 第14天假手術(shù)組 1．00 1．00 1．00模型組 1．57±0．25** 1．62±0．26** 1．69±0．26**水蛭素高劑量組 1．23±0．12*# 1．29±0．20*# 1．27±0．18*#水蛭素低劑量組 1．42±0．21* 1．37±0．19*# 1．44±0．22*#貝那普利組 1．35±0．18*# 1．31±0．17*# 1．40±0．21*#

MCP-1對(duì)單核/巨噬細(xì)胞有趨化和激活作用[4]；ICAM-1主要功能是使單核細(xì)胞激活并與內(nèi)皮細(xì)胞緊密黏附后穿出血管壁到達(dá)炎癥部位[5]。腎間質(zhì)內(nèi)毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞釋放MCP-1、ICAM-1后可引起單核/巨噬細(xì)胞激活并定向遷移、穿出毛細(xì)血管壁到達(dá)腎間質(zhì)中，引起一系列炎癥反應(yīng)。激活的單核/巨噬細(xì)胞能釋放TGF-β1，而TGF-β1已被大量研究證實(shí)能引起ECM分泌增多，能促進(jìn)腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生與發(fā)展。Yang等[6]的研究證實(shí)TGF-β1能誘導(dǎo)TEMT；而Zheng等[7]的研究則證實(shí)MCP-1可直接作用于腎小管上皮細(xì)胞，引起TEMT發(fā)生。與此同時(shí)，MCP-1與ICAM-1能直接影響ECM的合成，如Lee等[8]的研究指出在MCP-1能誘導(dǎo)腹膜間皮細(xì)胞發(fā)生EMT及ECM過(guò)度積聚；Paccosi等[9]的研究則表明應(yīng)用MCP-1合成抑制劑可抑制腎功能惡化過(guò)程，且這一作用可能與其減少了腎間質(zhì)中ECM過(guò)度沉積有關(guān)。ICAM-1在誘導(dǎo)單核/巨噬細(xì)胞激活與黏附過(guò)程之外，也能通過(guò)誘導(dǎo)ECM過(guò)度沉積導(dǎo)致腎功能惡化，如Janssen等[10]使用ICAM-1基因敲除小鼠證實(shí)了ICAM-1在腎損傷過(guò)程中可導(dǎo)致ECM過(guò)度沉積及腎功能進(jìn)行性惡化。

結(jié)合目前研究現(xiàn)狀，設(shè)計(jì)了本實(shí)驗(yàn)，旨在研究通過(guò)對(duì)凝血酶的干預(yù)，是否能對(duì)與RIF密切相關(guān)的MCP-1、ICAM-1兩種標(biāo)志物造成影響，從而在一定程度上抑制RIF的發(fā)生、發(fā)展，并研究凝血酶抑制劑水蛭素在上述一系列病理過(guò)程中的保護(hù)性作用。從MCP-1、ICAM-1等方面入手，以UUO大鼠為模型，進(jìn)行了為期14 d的研究。結(jié)果顯示：水蛭素高劑量組及水蛭素低劑量組均能不同程度地減輕UUO模型大鼠腎間質(zhì)損傷程度并抑制MCP-1、ICAM-1的表達(dá)，且水蛭素高劑量組相比水蛭素低劑量組有著更好的效果。在相同的劑量下，隨著給藥時(shí)間的延長(zhǎng)，水蛭素對(duì)MCP-1、ICAM-1表達(dá)的抑制作用可持續(xù)增強(qiáng)，如水蛭素低劑量組第3天ICAM-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量及第3、7天ICAM-1蛋白質(zhì)相對(duì)表達(dá)量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05），但在第 14 天時(shí)，水蛭素低劑量組ICAM-1 mRNA及蛋白質(zhì)相對(duì)表達(dá)量相比模型組均有一定降低（P＜0．05）。

綜上所述，通過(guò)本實(shí)驗(yàn)研究，可得出如下結(jié)論：水蛭素能不同程度地減輕UUO模型大鼠腎間質(zhì)損傷程度并下調(diào)MCP-1、ICAM-1 mRNA及蛋白質(zhì)的表達(dá)，且水蛭素高劑量組的下調(diào)作用更強(qiáng)。因此，水蛭素能在一定程度上下調(diào)RIF發(fā)生過(guò)程中腎間質(zhì)血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)的趨化因子、黏附因子水平，從而抑制單核/巨噬細(xì)胞趨化與激活，減輕單核/巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)及炎癥反應(yīng)，達(dá)到抑制腎間質(zhì)纖維化發(fā)生、發(fā)展的目的。其作用機(jī)制或與水蛭素抑制UUO模型大鼠腎間質(zhì)血管內(nèi)皮細(xì)胞凝血酶活性，進(jìn)而下調(diào)腎間質(zhì)MCP-1、ICAM-1 mRNA及蛋白的表達(dá)有關(guān)。