羅 德 蘇 松 劉向東 劉 江 陳鑫培 周鵬程 方 程 李 波

肝移植是目前終末期肝病唯一有效的治療手段，但在手術(shù)中移植肝不可避免的要經(jīng)歷冷保存過程[1]。冷保存損傷一直是影響移植物功能及受者存活率的最重要因素之一[2]。如何最大程度地減輕冷保存損傷、提高移植物存活率是肝臟移植領(lǐng)域面臨的巨大挑戰(zhàn)。長鏈非編碼RNA(long non-conding RNA，LncRNA)是指長度超過200個(gè)核苷酸，不具備蛋白質(zhì)編碼功能的RNA，大量研究表明其參與多種病理、生理過程[3]。目前LncRNA在肝冷保存損傷中的作用未見報(bào)道，本課題組前期通過建立小鼠肝臟冷缺血模型應(yīng)用二代測序技術(shù)比較了LncRNA表達(dá)譜變化，發(fā)現(xiàn)TUG1在冷缺血組織標(biāo)本中呈顯著低表達(dá)，本研究旨在通過建立細(xì)胞冷保存模型來探討TUG1對(duì)冷保存小鼠肝細(xì)胞的保護(hù)作用及其可能的機(jī)制[4]。

材料與方法

1.細(xì)胞與主要試劑：原代成年小鼠肝臟細(xì)胞(HC)、肝竇內(nèi)皮細(xì)胞(LSEC)購買自武漢原生原代生物醫(yī)藥科技有限公司。小鼠乳酸脫氫酶(LDH)ELISA試劑盒、CCK-8試劑盒購于南京建成公司。TUG1慢病毒由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司生產(chǎn)?？俁NA提取試劑盒購于美國Zymo Research公司，TUNEL試劑盒購于美國Sigma公司，EBM-2培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購于美國Gibco公司。RIPA 試劑、BCA 試劑盒購自碧云天公司，Bax、Bcl-2、Cyt-C、cleaved caspase-9、cleaved caspase-3 和cleaved PARP一抗購于英國Abcam公司，GRP78、PERK、p-eIF2α、CHOP、cleaved-caspase 12和cleaved-PARP一抗購于美國CST公司。

2.實(shí)驗(yàn)方法：(1)細(xì)胞培養(yǎng)：HC采用添加10%胎牛血清和雙抗的DMEM培養(yǎng)基，LSEC采用EBM-2培養(yǎng)基，在37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。(2)小鼠肝臟細(xì)胞冷保存損傷模型建立：將培養(yǎng)的HC和LSEC在4℃的細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)12h，然后在37℃、5%CO2正常培養(yǎng)條件培養(yǎng)2h來構(gòu)建細(xì)胞冷保存損傷模型。(3)TUG1表達(dá)的檢測：利用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，用紫外分光光度計(jì)測定樣品濃度。取500ng總RNA為模板，利用oligo dT和隨機(jī)引物合成cDNA，利用SYBRG reen染料法進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系：20μl，含cDNA 2μl，引物5pmol，SYBR Green Master mix 10μl；反應(yīng)條件：50℃ 2min；95℃ 15S、60℃ 1min 40個(gè)循環(huán)。結(jié)果用Ct值分析，以GAPDH基因作為內(nèi)參，折算為相對(duì)倍數(shù)確定基因表達(dá)的相對(duì)變化。所用引物采用Primer 3軟件設(shè)計(jì)，由上海生工生物工程股份有限公司合成，序列為：TUG1 上游引物：5′-GGCACCCAGTGTAAAGCA-3，下游引物：5′-AAGCAGCAGATAACAGAGTTGA-3′；GAPDH 上游引物：5′-GTCAACGGATTTGGTCTGTATT-3′，下游引物：5′-AGTCTTCTGGGTGGCAGTGAT-3′。(4)TUG1過表達(dá)慢病毒感染：感染前24h，將處于對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞以2×105個(gè)/孔的數(shù)量接種于6孔板中，每孔加入無抗生素的培養(yǎng)液2ml。按照病毒的感染復(fù)數(shù)等于20，將慢病毒與培養(yǎng)基混和均勻，后加入待感染細(xì)胞中。24h后換液，72h后熒光顯微鏡觀察并計(jì)算轉(zhuǎn)染效率。待細(xì)胞生長至匯合度為80%時(shí)，進(jìn)行常規(guī)傳代培養(yǎng)，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。(5)肝臟細(xì)胞冷保存損傷指標(biāo)的檢測：采用CCK-8試劑盒檢測細(xì)胞活性，ELISA試劑盒檢測細(xì)胞培養(yǎng)液上清中LDH含量，細(xì)胞凋亡程度通過 AnnexinV-FITC凋亡試劑盒和流式細(xì)胞儀檢測分析。(6)線粒體凋亡及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路相關(guān)蛋白檢測：利用蛋白質(zhì)印跡法檢測線粒體凋亡通路相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2、細(xì)胞色素C、cleaved caspase-9、cleaved caspase-3 和cleaved PARP及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路相關(guān)蛋白GRP78、PERK、p-eIF2α、CHOP、cleaved-caspase 12和cleaved-PARP的表達(dá)以確定線粒體凋亡通路及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路的變化。具體方法為：利用RIPA試劑提取細(xì)胞總蛋白，BCA定量后取30μg蛋白，經(jīng)聚丙烯凝膠電泳分離，經(jīng)轉(zhuǎn)膜 、封閉，抗體雜交后顯影，通過Image J 掃描灰度值后計(jì)算相對(duì)水平。

結(jié) 果

1.TUG1在冷保存模型中表達(dá)下調(diào):為了探索冷保存損傷模型中TUG1的表達(dá)變化，將HC和LSEC在4℃的細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)12h，然后在正常培養(yǎng)條件培養(yǎng)2h來構(gòu)建細(xì)胞冷保存損傷模型，通過q-PCR檢測TUG1的表達(dá)變化。如圖1所示，與正常培養(yǎng)細(xì)胞比較，冷保存模型中TUG1的表達(dá)明顯降低。

圖1 冷保存12h TUG1表達(dá)情況A.HC組；B.LSEC組；與正常培養(yǎng)細(xì)胞比較，*P<0.05

2.過表達(dá)TUG1降低冷保存導(dǎo)致的細(xì)胞損傷:為了探索TUG1對(duì)冷保存損傷的影響，通過慢病毒感染的方式在HC和LSEC中過表達(dá)TUG1，如圖2所示，與陰性對(duì)照比較，慢病毒感染后TUG1表達(dá)水平明顯升高。建立細(xì)胞冷保存損傷模型，流式細(xì)胞技術(shù)檢測細(xì)胞凋亡，如圖3所示，與陰性對(duì)照組比較，TUG1高表達(dá)組的細(xì)胞凋亡明顯降低。CCK-8法檢測細(xì)胞活性，如圖 4所示，高表達(dá)TUG1組細(xì)胞活性明顯高于陰性對(duì)照組。通過檢測細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH變化來判斷細(xì)胞損傷程度，如圖5所示，TUG1高表達(dá)能減輕LDH釋放。

圖2 慢病毒感染后TUG1表達(dá)情況A.HC組；B.LSEC組；與陰性對(duì)照組比較，*P<0.01

圖3 流式技術(shù)檢測細(xì)胞凋亡A.HC組；B.LSEC組;與陰性對(duì)照組比較，*P<0.01

圖4 CCK-8法檢測細(xì)胞活性A.HC組；B.LSEC組;與陰性對(duì)照組比較，*P<0.01

圖5 細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH變化A.HC組；B.LSEC組;與陰性對(duì)照組比較，*P<0.01

3.過表達(dá)TUG1對(duì)線粒體凋亡及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響:為了探討TUG1對(duì)冷保存損傷保護(hù)作用的潛在機(jī)制，首先通過Western blot法檢測了線粒體凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)變化。如圖6、圖7所示，與陰性對(duì)照組比較，TUG1慢病毒組的Bax，Cyt-c，cleaved caspase-9，cleaved caspase-3，cleaved PARP表達(dá)明顯降低，Bcl-2表達(dá)明顯上升。接著檢測了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白的表達(dá)變化，結(jié)果如圖8、圖9所示，與慢病毒陰性對(duì)照組比較，慢病毒組GPR78、PERK、p-eIF2α、CHOP、cleaved-caspase 12和cleaved-PARP表達(dá)明顯降低。

圖6 Western blot法檢測HC細(xì)胞線粒體凋亡相關(guān)蛋白與陰性對(duì)照組比較，*P<0.01

圖7 Western blot法檢測LSEC細(xì)胞線粒體凋亡相關(guān)蛋白與陰性對(duì)照組比較，*P<0.01

圖8 Western blot法檢測HC細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白與陰性對(duì)照組比較，*P<0.01

圖9 Western blot法檢測LSEC細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白與對(duì)照組比較,*P<0.01

討 論

肝移植過程中供肝通常需要在2～8℃條件下保存數(shù)小時(shí)。低溫能降低細(xì)胞代謝從而延長移植物保存時(shí)間[5,6]。但是，在冷保存期間，供肝N+-K+-ATP酶活性受到抑制，引起N+-Cl-內(nèi)流增加、繼發(fā)性胞內(nèi)Ca2+失衡以及細(xì)胞水腫。同時(shí)，無氧代謝導(dǎo)致線粒體功能障礙和中性粒細(xì)胞激活，促使大量自由基產(chǎn)生并損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞和細(xì)胞死亡，被認(rèn)為是術(shù)后移植物無功能的重要原因[7～9]。供肝短缺仍是肝移植領(lǐng)域中最根本的問題。有研究者認(rèn)為“邊緣供肝”是解決目前供肝短缺困境的有效途徑之一，然而邊緣供肝往往來源于老齡、伴發(fā)脂肪肝以及無心跳供體(nonheart-beating donors，NHBD)，對(duì)缺血再灌注及冷保存損傷的耐受性較差，原發(fā)性移植物無功能的發(fā)生率往往高于活體肝移植供體或腦死亡供體[1,2]。因此，對(duì)供肝冷保存采取必要的保護(hù)性干預(yù)措施，從而減小損傷、改善供肝質(zhì)量是目前肝移植研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)課題之一。雖然目前對(duì)于冷保存損傷已有不少研究，但其分子機(jī)制仍不清楚。為此，本課題組前期通過建立小鼠肝臟冷保存模型，利用二代測序技術(shù)篩選出差異表達(dá)的lncRNA TUG1，并重點(diǎn)探究其在冷保存中的作用及其潛在機(jī)制。

LncRNA是長度大于200個(gè)核苷酸的非編碼RNA，參與細(xì)胞內(nèi)多種生物學(xué)過程，但在肝臟冷保存損傷方面未見報(bào)道。?；撬嵘险{(diào)基因1(lncRNA taurine up-regulated gene1，LncRNA TUG1)最初是在篩選?；撬崽幚淼男∈笠暰W(wǎng)膜細(xì)胞基因組時(shí)被發(fā)現(xiàn)，其序列在哺乳動(dòng)物中高度保守。研究發(fā)現(xiàn)在新生視網(wǎng)膜細(xì)胞中通過RNA干擾技術(shù)沉默TUG1可以通過增加細(xì)胞凋亡而導(dǎo)致光感受器的畸形或外段缺失[10]。最近研究表明TUG1影響多種腫瘤細(xì)胞的凋亡和增殖。研究發(fā)現(xiàn)TUG1在骨肉瘤中表達(dá)普遍上調(diào)，并調(diào)控骨肉瘤細(xì)胞的增殖和凋亡[11]。也有研究報(bào)道高TUG1的表達(dá)水平與膀胱尿路上皮癌的高分級(jí)和分期有關(guān)，沉默TUG1的表達(dá)水平導(dǎo)致細(xì)胞增殖抑制和凋亡誘導(dǎo)[12]。

已有研究顯示，肝臟冷損傷始于HC和LSEC的損傷[13，14]。因此，本研究通過建立HC和LSEC冷保存損傷模型來探討TUG1作用及其機(jī)制。本研究中發(fā)現(xiàn)，TUG1在冷保存的肝臟細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，這與本研究前期的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致[4]。當(dāng)細(xì)胞通過慢病毒感染上調(diào)TUG1表達(dá)后，細(xì)胞凋亡及LHD水平明顯降低，細(xì)胞活力增加，這說明TUG1對(duì)冷保存損傷具有保護(hù)作用。既往研究表明細(xì)胞凋亡受線粒體功能障礙與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)途徑調(diào)節(jié)[15～17]。本研究通過蛋白印跡實(shí)驗(yàn)比較了TUG1上調(diào)后細(xì)胞色素C、線粒體凋亡相關(guān)蛋白及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白的表達(dá)變化來探討TUG1降低冷保存損傷的可能機(jī)制。結(jié)果顯示TUG1表達(dá)上調(diào)后，細(xì)胞色素C，線粒體凋亡相關(guān)蛋白及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白的表達(dá)明顯降低。綜上所述，筆者推測LncRNA TUG1可能通過抑制線粒體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路降低細(xì)胞凋亡，從而降低細(xì)胞冷保存損傷。