李勇，高書明，劉廣飛，王路，盧守亮，程才

(滄州市中心醫(yī)院骨一科，河北 滄州 061001)

骨肉瘤是最常見的間質(zhì)細(xì)胞來源的惡性腫瘤之一，其周圍血流豐富，早期可發(fā)生轉(zhuǎn)移，死亡率較高[1]。雖然手術(shù)技術(shù)的提高及放化療的應(yīng)用逐漸成熟，但是其5年生存率未見明顯提高[2]。隨著腫瘤基因研究越來越深入，分子靶向治療已成為近年來研究的熱點(diǎn)[3]。既往研究[4]發(fā)現(xiàn)骨肉瘤的發(fā)生與p14ARF、RB和p16INK4等原位基因激活或基因重組及突變有關(guān)。H19基因正常情況下的最終表達(dá)產(chǎn)物為RNA，但是當(dāng)異位H19的ORF6非翻譯區(qū)發(fā)生突變或者刪失可能會產(chǎn)生蛋白質(zhì)，并且可導(dǎo)致細(xì)胞的惡變。目前，相關(guān)研究[5-6]發(fā)現(xiàn)H19基因在多種惡性腫瘤中均為高表達(dá)，如膀胱癌、肺癌等。而H19基因與骨肉瘤之間的關(guān)系目前研究較少，本研究旨在探討H19基因在骨肉瘤中的表達(dá)及其對預(yù)后的影響。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取2014年4月至2018年4月滄州市中心醫(yī)院收治的肉瘤患者81例，所有患者均經(jīng)病理證實(shí)為骨肉瘤，同時選取非腫瘤組織作為配對研究，非腫瘤組織包括癌旁組織(距腫瘤邊緣<3 cm)及瘤遠(yuǎn)旁組織(距腫瘤邊緣>5 cm)。所有患者均經(jīng)放化療。入選患者中，男性48例，女性33例，年齡14～56歲，平均年齡(24.45±3.21)歲。所有病理標(biāo)本手術(shù)切除后保存于液氮中，用于后期檢測，所有入選患者均簽署了知情同意書，所有臨床病理資料通過翻閱病歷收集。

1.2 試劑

PCR反應(yīng)試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、內(nèi)切酶Rsa I、Trizol試劑、mRNA Marker I(北京天為時代)。H19及GAPDH的上下游引物(上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成)見表1。

表1H19及GAPDH的上下游引物

1.3 方法

1.3.1 RT-PCR (1)RNA提取：組織剪碎后用Trizol提取RNA，并用分光光度儀測純度及含量(A260/A280大約為1.8～2.0)。(2)RT-PCR：首先采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒，按照說明書進(jìn)行emRNA鏈合成，然后emRNA，按照PCR反應(yīng)試劑盒說明書進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性2 min，94℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72qc延伸30 s，循環(huán)30個周期后，最后72 ℃延伸7 min。PCR的參考體系為GAPDH。將H19及β-actin一起上樣，2%瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像儀分析電泳結(jié)果，Dolphin分析軟件測定灰度值，樣本的灰度值與β-actin的比值作為最終結(jié)果。

1.3.2 RFLP檢測H19印跡狀態(tài) 限制性酶切反應(yīng)體系：主要包括2μL 10×Buffer，10 U。內(nèi)切酶Rsa I，PCR產(chǎn)物37 ℃水浴酶切過夜，然后做瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察并照相。酶切后若為142 bp、247 bp或105 bp條帶，則為單等位基因表達(dá)，即正常印跡；若為3條不同的條帶(247 bp、105 bp和142 bp)，則為印記基因丟失(loss of imprinting，LOI)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0分析，計(jì)數(shù)資料以[n(%)]表示，采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 H19mRNA在骨肉瘤、癌旁組織及癌旁遠(yuǎn)組織的表達(dá)

將提取的mRNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，顯像后如圖1所示。H19mRNA在骨肉瘤組織中高表達(dá)，在癌旁組織及癌旁遠(yuǎn)組織中低表達(dá)。待測樣本中β-actin均有表達(dá)，提示標(biāo)本中總RNA及RT-PCR反應(yīng)有效。

2.2 RT-PCR-RFLP法檢測骨肉瘤中H19 mRNA印跡狀態(tài)

所有病理標(biāo)本中，骨肉瘤、癌旁組織及癌旁遠(yuǎn)組織的H19 mRNA表達(dá)率分別為43.2%，14.8%，3.7%，LOI的發(fā)生率與不同組織之間有顯著相關(guān)性(P<0.05)。見圖2。

2.3 H19基因與骨肉瘤臨床病理資料的關(guān)系

81例骨肉瘤患者中，H19基因表達(dá)與肺轉(zhuǎn)移，Enneking分期有關(guān)，且高表達(dá)的骨肉瘤患者2年生存率明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。H19基因表達(dá)與性別、年齡、腫瘤大小、部位及病理分型無明顯相關(guān)(P>0.05)。見表2。

表2H19基因與骨肉瘤臨床病理資料的關(guān)系(例)

3 討論

骨肉瘤作為最常見的間質(zhì)組織惡性腫瘤之一，惡性程度較高，早期易發(fā)生肺部轉(zhuǎn)移，預(yù)后較差。因此，尋找骨肉瘤發(fā)生發(fā)展的根源并找出治療靶點(diǎn)是目前研究治療骨肉瘤的熱點(diǎn)[7]。H19基因定位到人的染色體為11p15.5，基因長度為3 kb，其中主要包括4個內(nèi)含子和5個外顯子。目前，體內(nèi)尚未發(fā)現(xiàn)H19的蛋白表達(dá)，故認(rèn)為其可能不參與翻譯，但其mRNA水平可以檢測到，因此主要影響翻譯水平[8]。目前，研究[9]發(fā)現(xiàn)H19基因的突變及丟失率極高，均超過了p53基因。

近年來，研究發(fā)現(xiàn)H19基因與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。研究[10]發(fā)現(xiàn)H19mRNA通過調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲及血管形成的基因表達(dá)，影響腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。目前，已有研究[11]證實(shí)H19基因在多種腫瘤中的陽性率高于正常組織，如宮頸癌、腸癌及食管癌等，且其可以作為肝癌和宮頸癌的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及預(yù)后的評估因素之一。作為印跡蛋白，H19致癌的方式是雜合性丟失，或者單親二倍體，主要表現(xiàn)為同源染色體中兩條等為基因丟失或是突變活性導(dǎo)致其中一個抑癌基因的功能拷貝丟失，表達(dá)增加，或者是印跡控制中心的突變失去活性，最終導(dǎo)致多個印跡的癌基因表達(dá)異常[12]。

本研究指出H19mRNA在骨肉瘤組織中高表達(dá)，在癌旁組織及癌旁遠(yuǎn)組織中低表達(dá)，說明癌細(xì)胞中H19mRNA呈高表達(dá)狀態(tài)。其原因可能是H19mRNA可以通過多種途徑調(diào)節(jié)染色質(zhì)重構(gòu)、DNA甲基化、組蛋白修飾，且H19mRNA作為miRNA的前體，繼而從基因水平、轉(zhuǎn)錄水平以及蛋白質(zhì)翻譯水平調(diào)控機(jī)體的功能[13]。此外，LOI的發(fā)生率與不同組織之間有顯著相關(guān)性(P<0.05)。其原因可能是H19 基因可轉(zhuǎn)錄出一種長鏈非編碼 RNA H19，可以調(diào)節(jié)染色質(zhì)重構(gòu)、 DNA 甲基化，也可作為 miRNA 的前體，在細(xì)胞內(nèi)對組蛋白進(jìn)行修飾，繼而從基因水平、轉(zhuǎn)錄水平以及蛋白質(zhì)翻譯水平調(diào)控機(jī)體的功能。而不同組織中，H19基因與其產(chǎn)物miRNA呈現(xiàn)的表達(dá)水平不同，導(dǎo)致其LOI的發(fā)生率出現(xiàn)差異[14]。骨肉瘤患者中，H19基因表達(dá)與肺轉(zhuǎn)移、Enneking分期有關(guān)，且高表達(dá)的骨肉瘤患者2年生存率明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。這提示H19基因在轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平，其過表達(dá)與靶基因的狀態(tài)、細(xì)胞的類型、細(xì)胞的發(fā)育階段及臨床病理分級、激素及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，這與王彩霞等[15]研究結(jié)果相似。

綜上所述，H19基因在骨肉瘤中高表達(dá)，且與肺轉(zhuǎn)移、Enneking分期有關(guān)，H19基因高表達(dá)的患者預(yù)后差，H19基因可作為判斷骨肉瘤預(yù)后的指標(biāo)之一。