曲靖市中醫(yī)醫(yī)院，云南 曲靖 655000

去炎酊是由重樓、大黃、紅花、白芷、虎杖、紫草、草烏、獨(dú)定子、馬錢子、生南星、苦參等中藥經(jīng)滲漉制成的酊劑。有清熱除濕、瀉火解毒、活血化瘀、消腫止痛、消炎排膿之功效，主治跌打損傷、外傷感染、癰疽、瘡癤、蚊蟲叮咬、皮膚癢疹等。大黃為方中君藥，具有瀉下攻積、清熱瀉火、涼血解毒、逐瘀通經(jīng)、利濕退黃，用于實(shí)熱積滯便秘、血熱吐衄、目赤咽腫、癰腫疔瘡、腸癰腹痛、瘀血經(jīng)閉、產(chǎn)后瘀阻、跌打損傷、濕熱痢疾、黃疸尿赤、淋證，水腫，外治燒燙傷；虎杖具有利濕退黃、清熱解毒、散瘀止痛、止咳化痰，用于實(shí)熱黃疸、淋濁、帶下、風(fēng)濕痹痛、癰腫瘡毒、水火燙傷、經(jīng)閉、癥瘕、跌打損傷、肺熱咳嗽[1]?，F(xiàn)代藥理研究表明，大黃有瀉下、興奮胃腸平滑肌、對(duì)消化道黏膜保護(hù)、抗病原微生物及抗炎、保護(hù)心腦血管、抗腫瘤、保肝利膽等[2]作用；虎杖有抗炎、抗病毒、抗菌、調(diào)血脂、抗血栓、改變血流變、擴(kuò)張血管、保護(hù)心肌、抗氧化、抗腫瘤、改善阿爾茨海默病癥狀及預(yù)防艾滋病等[3]作用。去炎酊現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)簡單，沒有對(duì)處方中任何一味中藥進(jìn)行含量測(cè)定。本文參照中國藥典[1]及文獻(xiàn)[4-12]，建立了HPLC法測(cè)定去炎酊中游離大黃素和大黃酚含量的方法,為去炎酊的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器 島津LC-20AT型高效液相色譜儀(配有四元泵，自動(dòng)進(jìn)樣器，紫外檢測(cè)器，柱溫箱，真空在線脫氣機(jī)，LC solution工作站)(株式會(huì)社島津制作所)，AE240型電子天平(瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司)。

1.2 材料 去炎酊(曲靖市中醫(yī)醫(yī)院，批號(hào): ZD2017040，ZD2017041，ZD2017042，ZD2017043，規(guī)格：60 mL/瓶)；大黃素對(duì)照品(批號(hào):110756-201512，含量：98.7%)、大黃酚對(duì)照品(批號(hào):110796-201520，含量：99.2%)，以上對(duì)照品均購置于中國食品藥品檢定研究院；乙腈(德國默克公司)為色譜純；水為雙蒸水；其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對(duì)照品溶液 精密稱取大黃素和大黃酚對(duì)照品適量，用乙醇制成每1 mL分別含大黃素和大黃酚423.020和176.183 μg/mL的對(duì)照品溶液儲(chǔ)備液，精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液1 mL，置10 mL容量瓶中，用60%乙醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，即得對(duì)照品使用液。

2.1.2 供試品溶液 精密量取已搖勻的去炎酊10 mL，置25 mL容量瓶中，用60%乙醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，即得供試品溶液。

2.1.3 陰性樣品溶液 按處方比例及制法，制得不含大黃和虎杖的陰性樣品。按“2.1.2”項(xiàng)下方法制成陰性樣品溶液。

2.2 色譜條件 色譜柱：依利特C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，柱溫為30 ℃；流動(dòng)相：0.1%磷酸溶液-甲醇 (25∶75)；流速為1.0 mL/min；檢測(cè)波長為254 nm；進(jìn)樣量：10 μL。

2.3 線性關(guān)系考察 分別精密吸取“2.1.1”項(xiàng)下的對(duì)照品儲(chǔ)備液0.2、0.5、1.0、2.5、5.0 mL分別置10 mL容量瓶中, 加60%乙醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，即得標(biāo)準(zhǔn)系列。分別取10 μL進(jìn)樣，記錄峰面積。以質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo)，峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，分別得大黃素和大黃酚回歸方程為Y=36 418X-58 243，r=1.000 0(n=5)和Y=59 776X-39 442，r=1.000 0(n=5)。結(jié)果表明，大黃素和大黃酚的質(zhì)量濃度在分別在8.460 4～211.510 0和3.523 7～88.091 5 μg/mL的范圍內(nèi)與對(duì)應(yīng)峰面積呈良好的線性關(guān)系?；旌蠈?duì)照品、供試品及陰性樣品的色譜圖如圖1所示。

2.4 專屬性試驗(yàn) 吸取“2.1”項(xiàng)下的3種溶液，在“2.2”項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定，結(jié)果樣品在與對(duì)照品保留時(shí)間相應(yīng)位置上，有相應(yīng)的色譜峰，陰性樣品在與對(duì)照品保留時(shí)間相應(yīng)位置上，沒有相應(yīng)的色譜峰，表明陰性樣品不干擾測(cè)定。

2.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.1.1”項(xiàng)下的對(duì)照品使用液，在“2.2”項(xiàng)下的色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果，大黃素和大黃酚的RSD分別為0.23%和0.22%,表明儀器精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品(批號(hào)：ZD2017040)6份，每份10 mL，按“2.1.2”項(xiàng)下制備，在“2.2”項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定大黃素和大黃酚的含量，其含量的RSD分別為0.45%和0.51%。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.1.2”項(xiàng)下制備的同一樣品，室溫下放置，分別以0，2，4，8，16，24，36 h時(shí)，在“2.2”項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，大黃素和大黃酚的RSD分別為0.55%和0.60%,表明樣品36 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密量取已測(cè)定含量的去炎酊 (批號(hào)：ZD2017040)6份，每份5 mL，置25 mL容量瓶中，精密加入對(duì)照品儲(chǔ)備液1.3 mL，用60%乙醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，即得。在“2.2”項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定，測(cè)得大黃素和大黃酚的加樣回收率見表1。

2.9 樣品測(cè)定結(jié)果 取4批去炎酊，按“2.1.2”項(xiàng)下的方法制備，在“2.2”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定含量。結(jié)果見表2。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果 (n=6)

表2樣品含量測(cè)定結(jié)果 (mg/mL，n=2)

批號(hào)大黃素大黃酚ZD20170400.120 40.041 5ZD20170410.119 80.041 1ZD20170420.119 70.041 1ZD20170430.120 00.041 5

3 討論

3.1 檢測(cè)指標(biāo)的選擇 大黃和虎杖的主要成分是蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚，中國藥典[1]也是選擇上述5成分作為定量指標(biāo)，但從樣品測(cè)定結(jié)果看蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素甲醚含量相對(duì)較低，用作定量指標(biāo)誤差偏大，所以參考文獻(xiàn)[4-8,12]，選擇大黃素和大黃酚為大黃及虎杖的質(zhì)量控制指標(biāo)。

3.2 樣品提取溶劑及方法的選擇 由于樣品是酊劑，是60%的乙醇溶液，根據(jù)大黃素和大黃酚在乙醇中溶解度相對(duì)高些，并結(jié)合樣品的制法，選擇用60%乙醇作為提取溶劑，因?yàn)榇藰悠窞槿芤?，所以不需要長時(shí)間提取，實(shí)際上只要搖勻即可，經(jīng)試驗(yàn)，振搖5 min的提取方法，就能滿足回收率要求，而且簡單易行。

3.3 檢測(cè)波長的選擇 分別取大黃素、大黃酚對(duì)照品的60%乙醇溶液在200～550 nm范圍內(nèi)進(jìn)行紫外掃描，大黃素在221、254、289 nm處有最大吸收，大黃酚在225、257 nm處有最大吸收。用221 nm或225 nm的波長時(shí)，雜質(zhì)干擾峰偏多，用289 nm的波長時(shí)，大黃酚的響應(yīng)值偏低，參照中國藥典[1]及文獻(xiàn)[4-8,10-12]，并綜合其他波長處雜質(zhì)干擾峰的情況，將檢測(cè)波長定為254 nm比較合適。

3.4 流動(dòng)相的選擇 試驗(yàn)過甲醇-水系統(tǒng)和乙腈-水系統(tǒng)，但色譜峰有些拖尾，參照中國藥典[1]及文獻(xiàn)[4-11]，將水換成0.1%磷酸溶液，峰形變好，最后確定為0.1%磷酸溶液-甲醇系統(tǒng)，經(jīng)過對(duì)流動(dòng)相比例進(jìn)行反復(fù)調(diào)整，發(fā)現(xiàn)當(dāng)流動(dòng)相為0.1%磷酸溶液-甲醇(25∶75)時(shí)，分離良好，且分析時(shí)間適宜，最終確定為0.1%磷酸溶液-甲醇(25∶75)為本實(shí)驗(yàn)流動(dòng)相。

3.5 方法適用 大黃素和大黃酚有游離型與結(jié)合型兩種形態(tài)，因?yàn)楸痉椒]有進(jìn)行加酸水解，只能測(cè)定游離型的大黃素和大黃酚，要測(cè)定總的大黃素和大黃酚需要加酸水解將結(jié)合型的大黃素和大黃酚游離出來才能測(cè)定，所以需要加酸水解-加熱回流-液液萃取3個(gè)環(huán)節(jié)才能完成，操作繁瑣，測(cè)定游離型的大黃素和大黃酚也能有效控制本制劑中大黃和虎杖的質(zhì)量。

4 結(jié)論

去炎酊現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)修檢驗(yàn)項(xiàng)目缺少定量檢測(cè)方法。本文根據(jù)去炎酊組方工藝特點(diǎn)，參考相關(guān)文獻(xiàn)，選擇大黃素、大黃酚作為質(zhì)量控制指標(biāo)，用C18色譜柱，在254 nm波長處進(jìn)行檢測(cè)，柱溫30 ℃，用0.1%磷酸溶液-甲醇(25∶75)為流動(dòng)相，控制流速為1.0 mL/min，結(jié)果大黃素和大黃酚在各自濃度范圍內(nèi)均呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性、平均加樣回收試驗(yàn)結(jié)果符合要求。該方法專屬性強(qiáng)、簡單易行、節(jié)約時(shí)間和成本，可用于測(cè)定去炎酊中游離大黃素和大黃酚的含量。