1.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所，北京 100700；2.華北理工大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，河北 唐山 063210；3.北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，北京 100029

甲型H1N1流感病毒最早于2009年4月在墨西哥爆發(fā)[1]，隨即在全球范圍內(nèi)蔓延。世界衛(wèi)生組織初始將此型流感稱為“人感染豬流感”，后將其更名為“甲型H1N1流感”。2009年6月11日，世界衛(wèi)生組織將甲型H1N1流感警戒提升為6級(jí)，同年，中國(guó)明確將甲型流感病毒H1N1納入乙類傳染病，并采取甲類傳染病的預(yù)防和控制措施[2]。流感病毒具有易變異性和易傳染性，免疫力低下的人群更易受到攻擊[3]，因此，探尋兼具調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能的抗流感性肺炎藥物顯得尤為重要。喘可治注射液由淫羊藿、巴戟天組成，具有抗過(guò)敏、增強(qiáng)體液免疫與細(xì)胞免疫的功能，研究發(fā)現(xiàn)喘可治注射液還表現(xiàn)出一定的抗炎作用，可以減少細(xì)胞炎性因子TNF-α、IL-β、IL-18等的分泌，減輕大鼠肺葉局部炎癥反應(yīng)[4]。本研究通過(guò)建立免疫低下病毒性肺炎動(dòng)物模型，對(duì)喘可治注射液防治流感的藥效學(xué)作用進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1 材料

1.1 動(dòng)物及病毒株 ICR小鼠，SPF級(jí)，體重(14±1)g，雌雄各半，購(gòu)自北京維通利華試驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證編號(hào)：SCXK(京)2006-0009。甲型H1N1流感病毒鼠肺適應(yīng)株(FM/1/47株)，購(gòu)自中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制研究所，由本所ABSL-2試驗(yàn)室傳代，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 藥品及試劑 喘可治注射液，廣州健心藥業(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字Z20010172，批號(hào)20080905059，規(guī)格2 mL/支；達(dá)菲(磷酸奧司他韋膠囊)，瑞士巴塞爾豪夫邁·羅氏有限公司產(chǎn)品，上海羅氏制藥有限公司分裝，批號(hào)B1162，分裝批SH0033;注射用環(huán)磷酰胺：批號(hào)20090103，山西普德藥業(yè)有限公司產(chǎn)品；乙醚，北京試劑公司產(chǎn)品，批號(hào)20090707。

1.3 儀器 Applied Biosystems 7500型定量PCR儀，美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)(ABI)公司產(chǎn)品；TC-96/G/H(b) 梯度PCR儀，博日科技有限公司產(chǎn)品；HC-3018R高速冷凍離心機(jī)，中科中佳公司產(chǎn)品；MSC1.8型A2型生物安全柜，德國(guó)Thermo產(chǎn)品；YP/0001型動(dòng)物體重電子天平，上海越平科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；AR1140型動(dòng)物臟器電子天平，美國(guó)Chaus產(chǎn)品。

2 方法

2.1 給藥劑量設(shè)計(jì) 喘可治注射液成人臨床常規(guī)用量為8 mL/60 kg/d，試驗(yàn)時(shí)小鼠用量為1.5 mL/kg/d(相當(dāng)于人臨床用藥量的等效劑量)，試驗(yàn)時(shí)按等容不等濃0.2 mL/10 g腹腔注射給藥。達(dá)菲臨床用量為150 mg/60 kg，換算為小鼠等效劑量為27.5 mg/kg/d，按0.2 mL/10 g灌胃給藥。

2.2 病毒株處理甲型H1N1流感病毒(FM1株)，本室常規(guī)雞胚傳代，TCID50為1×10-4.5，-80 ℃冰箱保存。

2.3 流感病毒H1N1感染致小鼠肺炎模型 除正常對(duì)照組外，其余組小鼠按10 mL/kg皮下注射環(huán)磷酰胺(10 mg/kg)，每日1次，共2天，造成免疫低下模型[5]。除正常對(duì)照組、環(huán)磷酰胺組外，其余組小鼠用乙醚輕度麻醉，以15個(gè)LD50病毒液(FM1株)滴鼻感染，每只35 μL，造成免疫低下病毒性肺炎小鼠模型[3]。

2.4 分組及給藥 ICR小鼠隨機(jī)分為5組，分別為正常對(duì)照組、環(huán)磷酰胺對(duì)照組、模型對(duì)照組、達(dá)菲對(duì)照組(灌胃給藥)、喘可治注射液組(腹腔注射給藥)，每組10只。治療性實(shí)驗(yàn)：感染當(dāng)天開(kāi)始給藥，每天1次，連續(xù)4 d，第5天后稱重，處死小鼠，檢測(cè)各指標(biāo)。預(yù)防實(shí)驗(yàn)：各組給予相應(yīng)的藥物，每天1次，連續(xù)5 d，給藥第5天后，除正常對(duì)照組外，其它組小鼠用乙醚輕度麻醉，以15個(gè)LD50流感病毒液FM1株滴鼻感染，感染第4天后，稱重，處死小鼠，檢測(cè)各指標(biāo)。

2.5 引物設(shè)計(jì)與合成 引物設(shè)計(jì)：利用Primer Premier 5.0軟件進(jìn)行序列分析并設(shè)計(jì)引物，所設(shè)計(jì)引物的Tm值、GC含量及3′末端穩(wěn)定性等基本參數(shù)依據(jù)引物優(yōu)化原則。

引物合成：由上海英駿公司合成。針對(duì)流感病毒(H1N1)基因序列的上下游引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

2.6 Real-time RT-PCR擴(kuò)增 用液氮研磨肺組織后，使用Trizol提取肺組織中的RNA，用上述H1N1和GAPDH引物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，反應(yīng)體積為20 μL，反應(yīng)體系含樣本RNA 2 μL。反應(yīng)條件為：42 ℃ 5 min，95 ℃ 10 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，共40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后分析各檢測(cè)樣本Ct值。

2.7 計(jì)算方法 肺指數(shù)=肺濕重(g)/體重(g)；脾指數(shù)=脾濕重(g)/體重(g)；胸腺指數(shù)=胸腺濕重(g)/體重(g)；肺指數(shù)抑制率=(病毒對(duì)照組平均肺指數(shù)-實(shí)驗(yàn)組平均肺指數(shù))/(病毒對(duì)照組平均肺指數(shù)-正常對(duì)照組平均肺指數(shù))×100%。

病毒載量計(jì)算方法：使用相對(duì)定量的方法，以GAPDH作為內(nèi)對(duì)照，選擇一個(gè)樣品(Con)作為 Calibrator，計(jì)算方法如下：

ConΔCt=Con Ct-Con GAPDH Ct

樣本ΔCt=樣本Ct-樣本GAPDH Ct

樣本ΔΔCt=樣本ΔCt-ConΔCt

2-ΔΔCt是各處理組基因表達(dá)相對(duì)Calibrator的倍數(shù)改變。

相對(duì)含量的變化=2-ΔΔCt×100%

病毒載量抑制率=(病毒對(duì)照組病毒載量均值-實(shí)驗(yàn)組病毒載量均值)/病毒對(duì)照組病毒載量均值×100%。

3 結(jié)果

3.1 喘可治注射液對(duì)甲型流感病毒H1N1感染免疫低下小鼠肺炎模型的治療作用 甲型H1N1流感病毒FM1株感染免疫低下小鼠后，肺指數(shù)增高，脾、胸腺指數(shù)降低，三者與環(huán)磷酰胺組比較差異均有顯著性意義(P<0.01)。達(dá)菲對(duì)照組肺、脾、胸腺指數(shù)與模型對(duì)照組比較差異均有顯著性意義(P<0.01)。喘可治注射液組脾、胸腺指數(shù)升高，脾指數(shù)與模型對(duì)照組比較有顯著性意義(P<0.05)；喘可治注射液組肺指數(shù)有所降低，但與模型對(duì)照組比較無(wú)顯著性意義(P>0.05)。

表2 喘可治注射液對(duì)FM1株流感病毒免疫低下小鼠肺炎的治療作用

注：與環(huán)磷酰胺對(duì)照組比較，#P<0.05，##P<0.01；與模型對(duì)照組比較，**P<0.01

3.2 喘可治注射液對(duì)甲型流感病毒H1N1感染免疫低下小鼠肺炎模型的預(yù)防作用 采用甲型H1N1流感病毒FM1株感染免疫低下小鼠后，肺指數(shù)明顯增高，與環(huán)磷酰胺對(duì)照組比較差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；感染前預(yù)防性給予臨床等效劑量的喘可治注射液4 d，可明顯降低肺指數(shù)，與模型對(duì)照組比較差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

預(yù)防性給預(yù)喘可治注射液可明顯降低小鼠肺組織中FM1株流感病毒病毒載量，與模型對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，病毒載量抑制率可達(dá)58.68%。

表3喘可治注射液對(duì)FM1株流感病毒感染免疫低下小鼠肺炎的預(yù)防作用

組別劑量肺指數(shù)抑制率/%病毒載量抑制率/%正常對(duì)照組-0.62±0.06---環(huán)磷酰胺對(duì)照組-0.70±0.07---模型對(duì)照組-1.56±0.50##-1517839.97±391122.94-達(dá)菲對(duì)照組27.5mg/kg1.10±0.18**54.13376923.34±26710.71**75.17喘可治注射液1.5mL/kg0.93±0.18**73.59627217.53±31385.04**58.68

注：與環(huán)磷酰胺對(duì)照組比較，##P<0.01；與模型對(duì)照組比較，**P<0.01。

4 討論

環(huán)磷酰胺是目前臨床常用的一類經(jīng)典廣譜抗腫瘤藥物，但其有明顯的細(xì)胞毒性，治療過(guò)程中往往會(huì)殺傷體內(nèi)增生活躍的免疫細(xì)胞，致使機(jī)體免疫低下，甚至免疫紊亂[5]，因此，該藥常常被用來(lái)制備免疫低下動(dòng)物模型。應(yīng)用環(huán)磷酰胺造成免疫低下小鼠模型，操作簡(jiǎn)便，是動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中比較常用的一種方法[6-7]。甲型H1N1流感病毒屬于正粘病毒科A型流感病毒，攜帶有H1N1亞型豬流感病毒毒株包含禽流感、豬流感及人流感三種流感病毒的核糖核酸基因片斷，盡管不同亞型之間可以組成很多種流感病毒血清型，但是可造成人感染豬流感病毒的血清型主要有H1N1、H1N2和H3N2[8]，其中H1N1占的比例最大，因此，本實(shí)驗(yàn)采用甲型H1N1流感病毒FM1株感染免疫低下動(dòng)物造成肺炎模型。

當(dāng)流感病毒在肺臟支氣管上皮細(xì)胞和肺組織中大量增殖時(shí)，可引起嚴(yán)重的病理組織損傷，如肺部水腫、炎性滲出、充血等，導(dǎo)致支氣管炎和間質(zhì)性肺炎[9-10]，這些病理改變均可使肺臟重量增加，肺指數(shù)值越大，表示肺組織病變程度越嚴(yán)重，因而，肺指數(shù)可用來(lái)評(píng)價(jià)肺組織病變程度。而對(duì)病毒載量相對(duì)定量的分析，可表現(xiàn)出病毒復(fù)制動(dòng)力學(xué)[11]，也反映肺組織中病毒的濃度，是病毒增殖和免疫清除機(jī)制共同作用的結(jié)果[12]，因而，在判定疾病進(jìn)程和臨床治療效果上具有極大的價(jià)值[3]。

本研究成功建立了流感病毒感染免疫低下小鼠肺炎模型，以肺指數(shù)和病毒載量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，觀察喘可治注射液對(duì)甲型H1N1流感病毒FM1株感染免疫功能低下小鼠的防治作用，并與我國(guó)衛(wèi)生部推薦的治療流感主要藥物達(dá)菲進(jìn)行了比較研究，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，治療性給予喘可治注射液后，小鼠脾指數(shù)則升高明顯，與模型對(duì)照組比較有顯著性差異(P<0.01)，小鼠肺指數(shù)雖有明顯的降低趨勢(shì)，但與模型對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異(P>0.05)。預(yù)防性給予喘可治注射液后，肺指數(shù)及肺組織中毒病毒載量均明顯降低，與模型對(duì)照組比較有顯著性差異(P<0.01)，病毒載量抑制率達(dá)58.68%。以上數(shù)據(jù)證實(shí)，喘可治注射液對(duì)甲型H1N1流感病毒有明顯的抑制或殺滅作用，同時(shí)還具有免疫調(diào)節(jié)作用，可改善和提高機(jī)體的免疫功能，對(duì)感病毒感染免疫低下小鼠肺炎模型防治作用明顯。本研究為其臨床應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為今后免疫低下病毒性肺炎的藥效評(píng)價(jià)和免疫致病機(jī)制研究提供方法學(xué)參考。