聶晶晶，葉建斌，馬 科，周留柱，楊雪鵬

（鄭州輕工業(yè)學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，河南鄭州 450001）

淀粉是煙草生長過程中積累的重要碳水化合物，廣泛存在于煙草的莖葉中[1]，淀粉在煙葉細(xì)胞中的合成、積累、分解、轉(zhuǎn)化狀況，決定著烤后葉片內(nèi)部各種化學(xué)成分之間的協(xié)調(diào)程度，影響著煙葉品質(zhì)[2]。淀粉含量過高會影響燃燒速度和燃燒的完全性，產(chǎn)生焦煳氣味，對煙氣產(chǎn)生不良影響[3]。然而，淀粉經(jīng)降解可轉(zhuǎn)化為小分子碳水化合物，對煙氣有積極作用，并且促進(jìn)香味物質(zhì)的生成，可改善抽吸品質(zhì)[4]。目前，我國調(diào)制后煙葉淀粉含量偏高，是制約我國煙支品質(zhì)的重要因素[5]。據(jù)了解，國內(nèi)主要通過煙草育種、栽培、調(diào)制和醇化等方面來改善煙葉品質(zhì)[6]。新鮮煙葉淀粉含量達(dá)到40%左右，經(jīng)過卷煙加工，優(yōu)質(zhì)烤煙煙葉淀粉含量為1%～2%，但是對于等級較低的煙葉，經(jīng)過卷煙加工后，淀粉含量依然偏高。大量研究表明，煙葉淀粉的大量降解主要是在煙葉初烤、復(fù)烤和煙葉陳化過程中，其中微生物的降解發(fā)揮著重要的作用[7]。但是煙葉中存在的微生物是有限的，依據(jù)煙葉中存在的微生物，很難使煙葉中淀粉降解到優(yōu)質(zhì)烤煙的要求[7]。

因此，現(xiàn)在利用外加酶及微生物來降解煙葉淀粉成為煙草行業(yè)研究的熱點。試驗以前期從煙葉表面篩選出的降解淀粉的解淀粉芽孢桿菌Y11為研究對象，對其產(chǎn)酶條件進(jìn)行優(yōu)化，以淀粉酶酶活為響應(yīng)值，最終得到其最佳培養(yǎng)基成分及發(fā)酵條件。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌株，由前期試驗，從煙葉中篩選出1株可以高效降解淀粉的菌株，通過形態(tài)觀察、生理生化試驗和分子鑒定等手段，鑒定該菌株為解淀粉芽孢桿菌；葡萄糖、可溶性淀粉、玉米粉、蔗糖，以及（NH4）2SO4，MgSO4，CaCl2，F(xiàn)eSO4，K2PO4，天津市凱通化學(xué)試劑有限公司提供；酵母膏、蛋白胨、尿素等，北京奧博星生物技術(shù)責(zé)任公司提供；DNS試劑：稱取5 g的3,5-二硝基水楊酸，邊攪拌邊加入到300 mL的去離子水中，緩慢加入5 g NaOH，在50℃水浴鍋中水浴加熱、攪拌溶解，然后加入100 g酒石酸鉀鈉，1 g苯酚和2.5 g的無水亞硫酸鈉，攪拌溶解澄清后冷卻至室溫、用水定容至500 mL，貯藏在棕色試劑瓶中，在黑暗處放置1周以上使用。

752N型紫外可見分光光度計，河北潤聯(lián)科技開發(fā)有限公司產(chǎn)品；數(shù)顯恒溫水浴鍋，上海博迅實業(yè)有限公司產(chǎn)品；BSA124S型電子天平，賽多利斯科儀器（北京）有限公司產(chǎn)品；Hicen FR型高速冷凍離心機，德國英雄試驗儀器公司產(chǎn)品；GR85DA型高壓滅菌鍋，致微儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2 試驗方法

1.2.1 培養(yǎng)方法

種子培養(yǎng)：挑取菌株單菌落接種到50 mL種子培養(yǎng)液中，培養(yǎng)至OD值為2.0～2.5，得種子液，將種子液放置4℃冰箱中備用。

初始培養(yǎng)基：葡萄糖10 g，蛋白胨5.0 g，酵母膏5.0 g，氯化鈉10.0 g，1 000 mL，于121℃，20 min條件下滅菌。

發(fā)酵培養(yǎng)：取種子液1 mL接種于100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，在37℃，200 r/min條件下發(fā)酵培養(yǎng)40 h。

1.2.2 淀粉酶活的測定方法

將發(fā)酵液高速離心（4℃，10 000 r/min，10 min），液體即為粗酶液。取1 mL粗酶液，加入到1 mL，5 g/L的可溶性淀粉溶液中，酶解時間20 min，加0.5 mol/L鹽酸溶液1 mL混合均勻，加3 mL DNS試劑，沸水處理反應(yīng)5 min，然后稀釋到25 mL，測吸光度，計算酶活。對照為滅活的酶液，按照上訴操作。定義1 h酶解淀粉產(chǎn)生1 mg葡糖糖的酶量為一個酶活為1 U，單位為U/mL。

酶活=葡糖糖含量×N（60/n）.

式中：n——酶解時間；

N——粗酶液稀釋倍數(shù)。

1.2.3 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精確稱取葡萄糖0.10 g，溶解到蒸餾水中，加水定容至100 mL，將溶液配置為質(zhì)量濃度1.00 g/L的葡萄糖溶液，分別取0，2，4，6，8，10標(biāo)準(zhǔn)溶液定容至50 mL容量瓶中，即為質(zhì)量濃度0，0.04，0.08，0.12，0.16，0.20， 0.24 g/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別取2 mL加入3 mL DNS，沸水浴反應(yīng)5 min，冷卻后，以去離子水做空白對照校正，用紫外分光光度計于波長550 nm處測吸光度A。

1.2.4 菌株的培養(yǎng)基成分的優(yōu)化

（1）碳源試驗。在初始培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，氮源為蛋白胨10 g/L，酵母5 g/L，無機鹽為NaCl 5 g/L，分別以10 g/L玉米粉、可溶性淀粉、葡萄糖、蔗糖為碳源，酶活為響應(yīng)值，得出最佳碳源，再考查最佳碳源量對酶活的影響，分別取最佳碳源量5，10，15，20，25 g/L，于37℃，200 r/min條件下發(fā)酵培養(yǎng)40 h，測產(chǎn)生淀粉酶活性。

（2）氮源試驗。在初始培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，以淀粉質(zhì)量濃度為15 g/L，分別以10 g/L蛋白胨、（NH4）2SO4、酵母膏、尿素為氮源，測定酶活性，再對最佳氮源的添加量進(jìn)行優(yōu)化，其質(zhì)量濃度分別為5，10，15，20，25 g/L，發(fā)酵條件及測定方法同上。

（3）無機鹽試驗。在初始培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，碳源為可溶性淀粉15 g/L，氮源為酵母膏15 g/L，分別以 0.3 g/L K2HPO4，CaCL2，MgSO4，F(xiàn)eSO4作為無機鹽，再對最佳無機鹽的添加量進(jìn)行優(yōu)化，其質(zhì)量濃度為0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 g/L，發(fā)酵條件及測定方法同上。

1.2.5 響應(yīng)面分析試驗

采用Design Expert 8.0.6.1軟件對培養(yǎng)基成分分析進(jìn)行Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，對碳源（淀粉）、氮源（酵母膏）、無機鹽（MgSO4）三因素各設(shè)計3個水平。

Box-Behnken試驗設(shè)計因素水平見表1。

表1 Box-Behnken試驗設(shè)計因素水平/g·L-1

1.2.6 發(fā)酵培養(yǎng)條件優(yōu)化

（1） 培養(yǎng)溫度的優(yōu)化。在最佳培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，分別在20，25，30，35，40℃下，在轉(zhuǎn)速200 r/min，pH值7，接種量1%條件下，培養(yǎng)40 h后，測定淀粉酶活性，考查溫度對酶活的影響。

（2）pH值的優(yōu)化。設(shè)置pH值5.0，6.0，7.0，8.0，在培養(yǎng)溫度35℃，轉(zhuǎn)速200 r/min，接種量1%條件下，培養(yǎng)40 h后，測定淀粉酶活性，考查pH值對酶活的影響。

（3）接種量的優(yōu)化。設(shè)置接種量0.5%，1.0%，1.5%，2.0%，2.5%，在pH值7.0，培養(yǎng)溫度35℃，在轉(zhuǎn)速200 r/min，培養(yǎng)40 h條件下，測定淀粉酶活性，考查不同接種量對酶活的影響。

（4）正交試驗。在單因素水平的基礎(chǔ)上，再對溫度、接種量、pH值3個因素進(jìn)行正交試驗設(shè)計，各設(shè)置3個不同的水平，進(jìn)一步確定菌株產(chǎn)酶的最優(yōu)條件，采用L9（34）正交表進(jìn)行試驗。

正交試驗因素與水平設(shè)計見表2。

表2 正交試驗因素與水平設(shè)計

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)均用3次平行試驗的平均值表示，響應(yīng)面分析試驗應(yīng)用Design Expert軟件中的RSREG（Response Surface Regression）程序進(jìn)行響應(yīng)面回歸計算，并對回歸方程進(jìn)行方差分析和系數(shù)顯著性檢驗。正交試驗采用SPSS 17.0分析軟件，對正交數(shù)據(jù)進(jìn)行極差及方差分析。試驗數(shù)據(jù)采用Origin 9.1作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

按照DNS方法測定

葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線可知，吸光度與葡萄糖質(zhì)量濃度的回歸方程為Y=1.785 89X-0.011 54，相關(guān)系數(shù)R2=0.997 91，表明在0～0.3 g/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，葡萄糖質(zhì)量濃度與吸光度A線性關(guān)系良好。

2.2 初始發(fā)酵條件下菌株產(chǎn)酶動力學(xué)

菌株的發(fā)酵曲線見圖2。

圖2 菌株的發(fā)酵曲線

由圖2可知，菌體濃度及菌株產(chǎn)酶能力均隨著發(fā)酵時間先增大后減少，且二者呈現(xiàn)極顯著關(guān)系，菌株在發(fā)酵40 h時，產(chǎn)生淀粉酶達(dá)到最大；發(fā)酵時間大于40 h后，產(chǎn)淀粉酶酶活性下降，因此選擇40 h為最佳發(fā)酵產(chǎn)酶時間，進(jìn)行培養(yǎng)基成分及培養(yǎng)條件的優(yōu)化。

2.3 培養(yǎng)基成分優(yōu)化

2.3.1 碳源單因素試驗

培養(yǎng)基中的碳源是構(gòu)成菌體細(xì)胞和代謝產(chǎn)物的主要元素，又為微生物生命活動提供能量。同時還能作為菌株產(chǎn)生淀粉酶的誘導(dǎo)底物。選用淀粉、葡萄糖、蔗糖、玉米粉作為碳源進(jìn)行優(yōu)化，并對最佳碳源的量進(jìn)行優(yōu)化。

不同碳源對酶活的影響見圖3，淀粉質(zhì)量濃度對酶活的影響見圖4。

圖3 不同碳源對酶活的影響

圖4 淀粉質(zhì)量濃度對酶活的影響

由圖3可知，淀粉作為碳源時，酶活最高，這可能是因為淀粉酶在有淀粉誘導(dǎo)下更有利于淀粉酶的產(chǎn)生，因此選擇淀粉作為碳源。由圖4可知，淀粉量為15 g/L時，酶活最高。

2.3.2 氮源單因素試驗

氮源是組成菌體細(xì)胞和代謝產(chǎn)物的必需營養(yǎng)物質(zhì)，培養(yǎng)基中使用的氮源一般分為無機和有機2種氮源。選擇尿素、蛋白胨、酵母膏及硫酸銨為碳源，考查其對酶活的影響。

不同氮源對酶活的影響見圖5，酵母膏質(zhì)量濃度對酶活的影響見圖6。

圖5 不同氮源對酶活的影響

圖6 酵母膏質(zhì)量濃度對酶活的影響

由圖5可知，酵母膏作為氮源，酶活性最高，而無機氮NH4SO4作為氮源時，酶活性最低，說明無機氮源不利于該菌株產(chǎn)生淀粉酶。因此，選擇酵母膏作為最佳氮源，再對其質(zhì)量濃度進(jìn)行優(yōu)化。由圖6可知，酵母添加量在一定范圍內(nèi)可促進(jìn)淀粉酶的產(chǎn)生，超出這一范圍會不利于菌株的產(chǎn)酶，酵母膏質(zhì)量濃度為15 g/L時，酶活最高。

2.3.3 無機鹽單因素試驗

無機鹽在細(xì)胞中的含量雖然不多，但是生命活動所必需的，其主要功能是參與構(gòu)成菌體成分，作為酶的組成部分，維持酶的活性或調(diào)解滲透壓等。無機鹽含量不足或者過高時，菌株生長都會受到抑制，導(dǎo)致產(chǎn)酶能力下降。

不同無機鹽對酶活的影響見圖7，硫酸鎂質(zhì)量濃度對酶活的影響見圖8。

圖7 不同無機鹽對酶活的影響

圖8 硫酸鎂質(zhì)量濃度對酶活的影響

由圖6可知，MgSO4作為無機鹽時酶活性最高，圖7是MgSO4質(zhì)量濃度的優(yōu)化。由圖7可知，MgSO4質(zhì)量濃度為0.4 g/L時，酶活最高。

2.3.4 響應(yīng)面分析試驗

響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果見表3，回歸模型方差分析見表4。

表3 響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果

表4 回歸模型方差分析

利用Design Expert軟件，對表3數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行方差分析和模型的顯著性分析，結(jié)果見表4。對響應(yīng)面試驗的響應(yīng)值進(jìn)行多元二次回歸擬合，得到回歸模型方程為：

由表4可知，該模型p=0.000 1＜0.010 0，說明回歸模型可信度高。通過R2來判斷該模型的擬合度，R2=0.970 8，表明有97.08%的試驗數(shù)據(jù)可用此模型進(jìn)行解釋，進(jìn)一步說明回歸方程的擬合程度較好。

該模型的擬合度回歸方程各項方差分析表明，一次項A（淀粉）、B（酵母膏）對酶活影響是非常顯著的，C（MgSO4）對其酶活影響不顯著，二次項A2，B2，C2的影響是極顯著，但其交互作用AB，AC，BC是不顯著的，說明各具體試驗因素對響應(yīng)值的影響不是簡單的線性關(guān)系；由F值判斷，在選擇范圍內(nèi)，3個因素對淀粉酶活的影響順序為A>B>C。

2.3.5 響應(yīng)曲面圖分析各因素交互作用對酶活影響的響應(yīng)曲面圖見圖9。通過Design Expert軟件對3個試驗因素分別兩兩交互，做出響應(yīng)曲面圖。由圖9可知，淀粉與MgSO4對酶活的交互作用最強，其次是酵母膏與MgSO4，而淀粉與MgSO4的交互作用最弱。同時影響酶活最顯著的因素是淀粉，表現(xiàn)為其響應(yīng)面弧度變化最大，其次是酵母膏和MgSO4。

應(yīng)用Design Expert軟件得到培養(yǎng)基的最佳配方為淀粉質(zhì)量濃度16.29 g/L，酵母膏質(zhì)量濃度16.04 g/L，MgSO4質(zhì)量濃度0.42 g/L，此時酶活為60.069 6 U/mL，并對其進(jìn)行3次試驗驗證，得到酶活為60.11 U/mL，與理論值基本吻合，說明該回歸方程能比較真實地反映各因素對產(chǎn)生酶活的影響。

圖9 各因素交互作用對酶活影響的響應(yīng)曲面圖

2.3.6 培養(yǎng)條件優(yōu)化結(jié)果

（1）培養(yǎng)溫度優(yōu)化的結(jié)果。

培養(yǎng)溫度對酶活的影響見圖10。

圖10 培養(yǎng)溫度對酶活的影響

微生物在不同的生長溫度下，生長速率不同，在適合的溫度下微生物生長周期縮短，產(chǎn)酶量增多，因此找到微生物的最適產(chǎn)酶溫度，對于提高酶活性具有重要的意義[8]。由圖10可知，在溫度20～35℃，隨著溫度的上升，酶活性逐漸提高；到達(dá)35℃后，隨著溫度的上升，酶活性開始下降，因此解淀粉芽孢桿菌Y11的最佳發(fā)酵溫度是35℃。

（2）培養(yǎng)pH值的優(yōu)化結(jié)果。

初始pH值對酶活的影響見圖11。

培養(yǎng)基的pH值會影響菌體的形態(tài)和代謝產(chǎn)物的合成途徑，從而影響菌體的產(chǎn)酶能力。圖11是初始pH值對酶活影響的結(jié)果，從圖11中可以看出，該菌株的最佳發(fā)酵pH值為7.0。

（3）培養(yǎng)接種量的優(yōu)化結(jié)果。

圖11 初始pH值對酶活的影響

接種量對酶活的影響見圖12。

圖12 接種量對酶活的影響

由圖12可以看出，接種量在0.5%～1.5%時，酶活性隨著接種量的增加而增加，接種量為1.5%時，酶活性達(dá)到最大值，當(dāng)接種量大于1.5%，酶活性隨著接種量的增加而減少。因此，選擇接種量為1.5%作為最佳接種量。

（4）正交試驗優(yōu)化結(jié)果。

正交試驗設(shè)計與結(jié)果分析見表5，正交設(shè)計方差分析結(jié)果見表6。

采用正交試驗對菌株的發(fā)酵溫度、pH值、接種量進(jìn)行優(yōu)化，選出最佳組合。通過表6中p值可以看出，B'（pH值）、A'（溫度）對酶活影響是顯著的，而接種量在1%～2%的范圍內(nèi)對酶活影響是不顯著的。由表5數(shù)據(jù)極差分析，可知因素主次順序為B'>A'>C'。因素B'，即培養(yǎng)初始pH值對酶活影響最大，是極顯著的；因素C'，即接種量對酶活的影響最小，得到最佳培養(yǎng)條件為即培養(yǎng)溫度35℃，pH值7，接種量1.5%，經(jīng)過3次平行試驗得酶活為70.2 U/mL。

表5 正交試驗設(shè)計與結(jié)果分析

表6 正交設(shè)計方差分析結(jié)果

3 結(jié)論

通過單因素試驗、響應(yīng)面試驗及正交試驗對解淀粉芽孢桿菌Y11液體發(fā)酵產(chǎn)生淀粉酶的培養(yǎng)基成分及發(fā)酵培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳培養(yǎng)基成分為淀粉質(zhì)量濃度16.29 g/L，酵母膏質(zhì)量濃度16.04 g/L，MgSO4質(zhì)量濃度0.42 g/L，最佳培養(yǎng)條件為培養(yǎng)溫度35℃，pH值7，接種量1.5%，得到酶活為70.2 U/mL，初始培養(yǎng)條件下酶活25.2 U/mL，優(yōu)化后酶活提高了1.8倍。試驗的解淀粉芽孢桿菌Y11在經(jīng)過條件優(yōu)化后，產(chǎn)淀粉酶能力顯著提升，在煙草本源微生物產(chǎn)淀粉酶能力中處于較高的產(chǎn)酶水平，對于微生物降解煙葉中的淀粉具有重要的意義。