陳彥雄，馬騰臻，李 蔚，潘陸霞，韓舜愈

（1.甘肅祁連葡萄酒業(yè)有限公司，甘肅高臺(tái) 734304；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅省葡萄與葡萄酒工程學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅省葡萄與葡萄酒產(chǎn)業(yè)技術(shù)研發(fā)中心，甘肅蘭州 730070）

香氣是構(gòu)成葡萄酒品質(zhì)的主要因素之一，決定著產(chǎn)品的品種典型性和產(chǎn)地風(fēng)格[1]。葡萄汁和葡萄酒中呈花香和果香味的萜烯類、C13降異戊二烯類和苯衍生物等品種香氣物質(zhì)以游離態(tài)和糖苷鍵合態(tài)形式存在，且以鍵合態(tài)形式存在的風(fēng)味前體物含量遠(yuǎn)高于游離態(tài)形式[2-3]。這些糖苷鍵合態(tài)香氣物質(zhì)可在釀造過(guò)程中通過(guò)酸水解或酶水解作用轉(zhuǎn)化成揮發(fā)性的、可被感知的游離態(tài)香氣物質(zhì)，但酸水解在葡萄酒釀造條件下相當(dāng)緩慢，作用有限；酶水解則因其作用條件較為溫和，且迅速受到廣泛關(guān)注。因此，糖苷酶在分解風(fēng)味前體物及調(diào)控葡萄酒香氣品質(zhì)方面具有重要作用[4-5]。

β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase，EC3.2.1.21）能夠水解結(jié)合于非還原性末端的β-葡萄糖苷鍵，釋放出β-D-葡萄糖和相應(yīng)的糖苷配基，是水解鍵合態(tài)糖苷前體物質(zhì)的關(guān)鍵酶[5-6]。有學(xué)者研究表明，來(lái)源于黑曲霉的商品酶制劑可使處理酒樣中的單萜類物質(zhì)含量顯著增加，花香和果香味也更加濃郁，風(fēng)味品質(zhì)顯著提高[7-8]，但純化該酶制劑所需成本較高，很難大規(guī)模應(yīng)用于葡萄酒生產(chǎn)中。近年來(lái)研究表明，部分釀酒酵母和非釀酒酵母也能產(chǎn)生β-葡萄糖苷酶[9]，從而使葡萄原料的風(fēng)味特征在酒體中得到充分表達(dá)[10]，對(duì)葡萄酒的風(fēng)味形成具有十分重要的意義。

酵母β-葡萄糖苷酶存在于細(xì)胞外、細(xì)胞膜表面和細(xì)胞內(nèi)，但只有胞外酶和胞膜酶才能水解糖苷鍵合態(tài)香氣前體物，胞內(nèi)酶的作用十分有限[11-12]。發(fā)酵結(jié)束后，酵母細(xì)胞在重力作用下沉降，作為酒泥除去，而胞外酶活性則可維持較長(zhǎng)時(shí)期，是葡萄酒品種香氣調(diào)控的關(guān)鍵酶。然而在酒精發(fā)酵過(guò)程中，具有 β-葡萄糖苷酶活性的釀酒酵母在葡萄酒環(huán)境條件下的產(chǎn)酶能力及糖苷酶活性均較低[8]，葡萄醪中碳源、氮源、pH值、多酚、SO2等釀造因子對(duì)酵母β-葡萄糖苷酶活性的影響是葡萄酒釀造過(guò)程中品種香氣調(diào)控亟需解決的關(guān)鍵問(wèn)題之一。

試驗(yàn)以一株β-葡萄糖苷酶活力較高的商品釀酒酵母為出發(fā)菌株，通過(guò)單因素試驗(yàn)研究了不同釀造條件對(duì)該菌株酒精發(fā)酵過(guò)程中β-葡萄糖苷酶活性的影響，以期為葡萄酒釀造過(guò)程中酵母糖苷酶的增香應(yīng)用提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

商業(yè)釀酒酵母，Vintage Red（VR），意大利Enartis公司提供。

對(duì)硝基苯基β-D-吡喃葡萄糖苷（p-NPG，4-Nitrophenyl β-D-glucopyranoside，純度 >98%），美國(guó)Sigma公司提供；胰蛋白胨、蛋白胨、酵母浸粉，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司提供；檸檬酸、無(wú)水磷酸氫二鈉、無(wú)水碳酸鈉、肌醇、偏重亞硫酸鈉、對(duì)硝基苯酚（p-NP）、葡萄糖、纖維二糖、D-麥芽糖、蔗糖、D-果糖、麥芽浸膏粉、糊精、葡萄皮、硝酸鈉、硫酸銨、磷酸氫二銨（DAP）、尿素、酒石酸氫鉀、L-蘋(píng)果酸、檸檬酸、硫酸鎂、氯化鈣等，以上試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

YPD液體培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母浸粉10 g/L，超純水，pH值5.0，在121℃下滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

HH-S型電熱恒溫水浴鍋，金壇市恒豐儀器制造有限公司產(chǎn)品；H2050R型高速冷凍離心機(jī)，長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司產(chǎn)品；CP214型電子天平，奧豪斯儀器（上海）有限公司產(chǎn)品；紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，Thermo Fisher scientific公司產(chǎn)品；SYQDSX-280B型手提式不銹鋼壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠產(chǎn)品；SPX-150-Ⅱ型生化培養(yǎng)箱，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司產(chǎn)品；SW-CJ-2FD型潔凈工作臺(tái)，蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司產(chǎn)品；18100摩爾型超純水機(jī)，重慶摩爾水處理設(shè)備有限公司產(chǎn)品；NRY-200型空氣恒溫?fù)u床，上海南榮實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司產(chǎn)品；單道移液器，德國(guó)Eppendorf公司產(chǎn)品；PHS-3C pH計(jì)，上海雷磁有限公司產(chǎn)品。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 菌株的活化與培養(yǎng)

按推薦用量（0.2 g/L）稱取于4℃下保存的紅佳釀活性干酵母，于38℃下復(fù)水活化30 min后接種至含有200 mL模擬葡萄汁的250 mL三角瓶中，在28℃下靜置培養(yǎng)，每天搖瓶6次，發(fā)酵結(jié)束后（殘?zhí)橇啃∮? g/L）取樣測(cè)定OD600值和上清液酶活，每個(gè)樣品重復(fù)3次。

1.3.2 模擬葡萄汁的配制

模擬葡萄汁[13]：葡萄糖、果糖各100 g/L，酒石酸氫鉀2.5 g/L，L-蘋(píng)果酸3.0 g/L，檸檬酸0.2 g/L，氨基態(tài)氮1.5 g/L（酵母浸粉，含3.75%氨基態(tài)氮，折算后加入量為 16 g/L），K2HPO41.14 g/L，MgSO4·7H2O 1.23 g/L，CaCl2·2H2O 0.44 g/L， MnCl2·4H2O 0.2 mg/L，ZnCl20.135 mg/L，肌醇100 mg/L，偏重亞硫酸鈉120 mg/L，煙酸 2 mg/L，吡哆醇2 mg/L，泛酸鈣1 mg/L，維B10.5 mg/L，葉酸 0.2 mg/L，核黃素0.2 mg/L，維H 0.125 mg/L；超純水，于121℃下滅菌20 min。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

準(zhǔn)確稱取對(duì)硝基苯酚（p-NP）139.0 mg，溶解于蒸餾水并定容至1 000 mL，分別吸取0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6 mL于10 mL容量瓶中，用濃度為1 mol/L Na2CO3溶液定容后混勻，以蒸餾水為空白，于波長(zhǎng)400 nm處測(cè)定吸光度并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[13]。

對(duì)硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖1。

1.3.4 β-葡萄糖苷酶活性測(cè)定

取5 mL培養(yǎng)液于4℃條件下以轉(zhuǎn)速8 000 r/min離心10 min，收集上清液。取100 μL上清液，加入200 μL p-NPG（濃度為40 mmol/L溶于pH值5.5檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液中，P-C緩沖液）混勻，于50℃下反應(yīng)10 min，立即加入濃度為1 mol/L Na2CO3溶液2 mL終止反應(yīng)并顯色，于波長(zhǎng)400 nm處測(cè)定吸光度[13]，以加熱失活的酶液按照同樣的處理作為空白。β-葡萄糖苷酶的酶活定義為pH值5.5，溫度50℃條件下，每分鐘1 mL酶液催化生成的對(duì)硝基苯酚的μmol數(shù)。

酶活力計(jì)算方式如下：

式中：U——酶活力單位，U/mL；

C——對(duì)硝基苯酚的濃度，μmol/mL；

V——反應(yīng)體系的體積，mL；

N——稀釋倍數(shù)；

t——反應(yīng)時(shí)間，min；

0.1 ——所取上清液或細(xì)胞液的體積，mL。

β-葡萄糖苷酶酶活力單位（U）定義為，在上述反應(yīng)條件下，1 min時(shí)間內(nèi)底物被釋放出1 μmol的p-NP所需要的酶量[14]。

1.3.5 酵母細(xì)胞OD600值測(cè)定

收集1.3.4中的酵母細(xì)胞，用無(wú)菌水清洗2次，將酵母細(xì)胞重新懸浮于5 mL的無(wú)菌水中，于波長(zhǎng)600 nm處測(cè)定其吸光度。

1.3.6 釀造條件對(duì)酵母產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的影響

（1）初始碳源濃度。分別配制初始碳源質(zhì)量濃度為150，175，200，225，250 g/L的模擬葡萄汁，按1.2.1方法活化并接種酵母，于28℃下靜置培養(yǎng)10 d，取樣測(cè)定OD600值及上清液酶活，重復(fù)測(cè)定2次。

（2）復(fù)合碳源種類。分別向模擬葡萄汁中加入1%以下碳源：葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、麥芽浸膏粉、纖維二糖、糊精、果糖、葡萄皮，按1.2.1方法活化并接種酵母，于28℃條件下靜置培養(yǎng)10 d，取樣測(cè)定OD600值及上清液酶活，重復(fù)測(cè)定2次。

（3）氮源種類。將模擬葡萄汁中的酵母浸粉換成以下氮源：硫酸銨、磷酸氫二銨（DAP）、硝酸鈉、尿素、酵母浸粉、蛋白胨、胰蛋白胨，其余成分不變，按1.2.1方法活化并接種酵母，于28℃下靜置培養(yǎng)10 d，取樣測(cè)定OD600值及上清液酶活，重復(fù)測(cè)定2次。

（4）有機(jī)氮與無(wú)機(jī)氮之比。以酵母浸粉和磷酸氫二銨為試材，根據(jù)有機(jī)氮與無(wú)機(jī)氮之比分別為1∶1，1∶2，2∶1，1∶3，3∶1配制模擬葡萄汁，按1.2.1方法活化并接種酵母，于28℃條件下靜置培養(yǎng)10 d，取樣測(cè)定OD600值及上清液酶活，重復(fù)測(cè)定2次。

（5）初始pH值。用檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液配制初始pH值分別為3.5，4.0，4.5，5.0，5.5，6.0的模擬葡萄汁，按1.2.1方法活化并接種酵母，于28℃下靜置培養(yǎng)10 d，取樣測(cè)定OD600值及上清液酶活，重復(fù)測(cè)定2次。

（6）SO2添加量。分別配制 SO2質(zhì)量濃度為10，30，60，90，120 mg/L的模擬葡萄汁，按1.2.1方法活化并接種酵母，于28℃下靜置培養(yǎng)10 d，取樣測(cè)定OD600值及上清液酶活，重復(fù)測(cè)定2次。

（7）多酚濃度。分別配制多酚（一水合沒(méi)食子酸）質(zhì)量濃度為0，0.5，1.0，1.5，2.0 g/L的模擬葡萄汁，按1.2.1方法活化并接種酵母，于28℃條件下靜置培養(yǎng)10 d，取樣測(cè)定OD600值及上清液酶活，重復(fù)測(cè)定2次。

2 結(jié)果與分析

2.1 初始碳源質(zhì)量濃度對(duì)酵母β-葡萄糖苷酶活性的影響

初始碳源質(zhì)量濃度對(duì)酵母β-葡萄糖苷酶活性的影響見(jiàn)圖2。

圖2 初始碳源質(zhì)量濃度對(duì)酵母β-葡萄糖苷酶活性的影響

碳源是維持微生物生命活動(dòng)的主要能源，是產(chǎn)生各種代謝產(chǎn)物的重要元素。由圖2可知，模擬酒中生物量隨碳源質(zhì)量濃度的升高而升高；但酶活呈先增大、后減小的變化趨勢(shì)，初始碳源質(zhì)量濃度為175 g/L時(shí)達(dá)到最大值。這可能是由于碳源質(zhì)量濃度的升高有利于酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)，但含量過(guò)高時(shí)使得其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)（如氮源、生長(zhǎng)因子等）相對(duì)不足，無(wú)法提供酶合成所需的營(yíng)養(yǎng)成分。碳源質(zhì)量濃度為175 g/L時(shí)，菌株酶活最大，這可能是由于在該質(zhì)量濃度下，菌株生物量較高，同時(shí)對(duì)各種物質(zhì)的利用較為充分所致。而當(dāng)葡萄糖質(zhì)量濃度達(dá)到225 g/L和250 g/L時(shí)，酶活明顯降低，這可能是由于高質(zhì)量濃度的碳源對(duì)糖苷酶的酶活有抑制作用[15]。

2.2 復(fù)合碳源對(duì)酵母β-葡萄糖苷酶活性的影響

復(fù)合碳源對(duì)酵母β-葡萄糖苷酶活性的影響見(jiàn)圖3。

圖3 復(fù)合碳源對(duì)酵母β-葡萄糖苷酶活性的影響

β-葡萄糖苷酶是誘導(dǎo)酶，碳源是該酶合成的誘導(dǎo)物質(zhì)，復(fù)合碳源一般比單一碳源更有利于酶的合成[16]。由圖3可知，與以葡萄糖為單一碳源相比，以麥芽浸膏粉為復(fù)合碳源的模擬葡萄汁進(jìn)行模擬發(fā)酵時(shí)，菌株生物量和β-葡萄糖苷酶活性均有所提升，這可能是因?yàn)辂溠拷喾酆胸S富的低聚糖及生長(zhǎng)因子，在促進(jìn)酵母菌生長(zhǎng)的同時(shí)可誘導(dǎo)其糖苷酶的合成。

2.3 不同氮源種類對(duì)酵母β-葡萄糖苷酶活性的影響

不同氮源對(duì)酵母β-葡萄糖苷酶活性的影響見(jiàn)圖4。

圖4 不同氮源對(duì)酵母β-葡萄糖苷酶活性的影響

氮源亦會(huì)影響細(xì)胞的正常生長(zhǎng)繁殖和代謝產(chǎn)物的分泌[17]，由圖4可知，不同氮源對(duì)模擬發(fā)酵中酵母細(xì)胞生物量及β-葡萄糖苷酶活性影響很大。在上述8種氮源中，酶活性最高的是以DAP（磷酸氫二銨）為唯一氮源的模擬葡萄汁，這可能是因?yàn)镈AP本身是酵母細(xì)胞生長(zhǎng)及次級(jí)代謝產(chǎn)物積累過(guò)程中的優(yōu)良氮源，其所含的磷酸鹽是酵母細(xì)胞壁及酶合成的重要前體物[17]。模擬葡萄汁中酵母浸粉和蛋白胨等有機(jī)氮源酶活較低的可能原因是氮含量差異所致，酵母浸粉中氨基態(tài)氮的含量約為3.75%，而相同質(zhì)量情況下DAP中氮含量則更高。

2.4 有機(jī)氮與無(wú)機(jī)氮比值對(duì)酵母β-葡萄糖苷酶活性的影響

有機(jī)氮與無(wú)機(jī)氮比值對(duì)酵母β-葡萄糖苷酶活性的影響見(jiàn)圖5。

圖5 有機(jī)氮與無(wú)機(jī)氮比值對(duì)酵母β-葡萄糖苷酶活性的影響

由圖5可知，有機(jī)氮與無(wú)機(jī)氮比值對(duì)模擬酒中酵母細(xì)胞生物量及β-葡萄糖苷酶活性影響很大，隨著有機(jī)氮與無(wú)機(jī)氮比值的增大，酶活逐漸增大，而菌體生物量逐漸降低。這可能與酵母浸粉不僅用作氮源，而且也是生長(zhǎng)因子、多種維生素和微量元素等的來(lái)源有關(guān)[17]。

2.5 初始pH值對(duì)酵母β-葡萄糖苷酶活性的影響

初始pH值對(duì)酵母β-葡萄糖苷酶活性的影響見(jiàn)圖6。

由圖6可知，隨著pH值的增大，酶活呈先增加后減小趨勢(shì)，其中pH值為5.0和5.5時(shí)酶活均較高，但此時(shí)菌體生物量卻較低。這可能與β-葡萄糖苷酶是一種酸性蛋白[18]，在弱酸性條件下更有利于菌體產(chǎn)酶所致。

圖6 初始pH值對(duì)酵母β-葡萄糖苷酶活性的影響

2.6 SO2濃度對(duì)酵母β-葡萄糖苷酶活性的影響

SO2濃度對(duì)酵母β-葡萄糖苷酶活性的影響見(jiàn)圖7。

圖7 SO2濃度對(duì)酵母β-葡萄糖苷酶活性的影響

由圖7可知，不同濃度SO2對(duì)紅佳釀酵母生物量的影響較小，而對(duì)其β-葡萄糖苷酶產(chǎn)量的影響較大，隨著SO2濃度的增大，酶活先減小后增大，當(dāng)SO2濃度為30 mmol/L時(shí)酶活最低，這可能是由于在低濃度（10 mmol/L）時(shí)，其對(duì)釀酒酵母的生長(zhǎng)無(wú)影響；而當(dāng)SO2濃度較高時(shí)，酵母細(xì)胞處于一種抗性環(huán)境中，其生長(zhǎng)和繁殖周期延長(zhǎng)所致[19]。

2.7 多酚質(zhì)量濃度對(duì)酵母β-葡萄糖苷酶活性的影響

多酚質(zhì)量濃度對(duì)酵母β-葡萄糖苷酶活性的影響見(jiàn)圖8。

圖8 多酚質(zhì)量濃度對(duì)酵母β-葡萄糖苷酶活性的影響

由圖8可知，多酚含量對(duì)酵母菌生物量的影響較小，但隨著多酚質(zhì)量濃度的增加，酵母菌酶活力呈增大趨勢(shì)，其中多酚質(zhì)量濃度為0.5 g/L時(shí)酶活最低，這可能是由于多酚抑制酵母特定的酶或與金屬離子結(jié)合，抑制了β-葡萄糖苷酶的合成；而當(dāng)多酚質(zhì)量濃度較高時(shí)，其對(duì)酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)及繁殖有抑制作用，該環(huán)境條件下可能更有利于糖苷酶的合成[20]。

3 結(jié)論

試驗(yàn)結(jié)果表明，初始碳源質(zhì)量濃度為175 g/L，以1%麥芽浸膏粉為附加碳源，DAP為單一氮源，有機(jī)氮（酵母浸粉）與無(wú)機(jī)氮（DAP）比例為3∶1，模擬汁初始pH值為5.5時(shí)更有利于釀酒酵母β-葡萄糖苷酶的分泌，SO2和多酚在較低濃度時(shí)對(duì)酵母產(chǎn)酶無(wú)影響，但較高濃度時(shí)有促進(jìn)作用。