張瑞雪 ，馬勇 ，劉宇，劉博，谷瑞增 ，魏穎 *

1. 中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司（北京 100015）；2. 北京市蛋白功能肽工程技術(shù)研究中心（北京 100015）；3. 寧夏光彩生物科技有限公司（銀川 750004）

人類膚色與黑素細(xì)胞生成的黑色素在皮膚中的含量和分布狀態(tài)有關(guān)，美白作用主要是防止色素的生成及促使生成的色素排出體外2條途徑。黑色素的合成必需有3種物質(zhì)：底物酪氨酸、反應(yīng)關(guān)鍵酶——酪氨酸酶及氧元素[1]。酪氨酸酶是一種含銅的氧化還原酶，廣泛存在于生物體中，是黑色素生成的限速酶，催化L-酪氨酸為L(zhǎng)-左旋多巴（L-DOPA），進(jìn)一步被氧化成L-多巴醌，合成黑色素[2]。隨著現(xiàn)代社會(huì)科技和經(jīng)濟(jì)高速發(fā)展，生活節(jié)奏加快，越來越多的年輕人開始熬夜，導(dǎo)致黑色素沉積，無法正常排出體外，皮膚暗黃無光，最終形成色斑。隨著化妝品行業(yè)的發(fā)展和成熟，消費(fèi)者對(duì)美白護(hù)膚產(chǎn)品要求越來越高，開發(fā)安全有效的美白產(chǎn)品顯得尤為重要。酵素在化妝品行業(yè)中應(yīng)用廣泛，有重要的研究?jī)r(jià)值和意義。

酵素原是日本對(duì)于酶的稱呼，后相繼傳入臺(tái)灣和大陸，酶是一種具有催化作用的生物活性分子，能降低反應(yīng)的活化能，從而加快反應(yīng)速度，是一種狹義上的酵素。目前酵素具有廣泛意義，不僅包括酶，還包括產(chǎn)酶微生物、相關(guān)調(diào)控因子及代謝產(chǎn)物等，其富含多種維生素、礦物質(zhì)、低聚糖、多酚、功能性酶類等，具有抗氧化、抑菌消炎、解酒護(hù)肝、調(diào)節(jié)腸道菌群等功能。酵素發(fā)酵主要是利用酵母菌、乳酸菌和霉菌對(duì)原料水果、蔬菜、糙米、菇類和藥食同源中藥等進(jìn)行微生物代謝活動(dòng)，實(shí)現(xiàn)糖類、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)三大物質(zhì)之間的轉(zhuǎn)化[3]。人體皮膚中存在多種酵素，以幫助表皮細(xì)胞的再生及皮脂腺、汗腺的分泌，能為皮膚細(xì)胞帶來活力，加快其新陳代謝[4]。有研究表明酵素產(chǎn)品具有美白抗衰老功能，能抵御紫外線對(duì)皮膚的傷害，抑制酪氨酸酶的活性，減少黑色素的生成。試驗(yàn)主要研究比較3種不同果蔬酵素對(duì)酪氨酸酶活的抑制作用、黑色素生成量及抗氧化能力的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

果蔬酵素（寧夏光彩生物科技有限公司）；臺(tái)灣大漢酵素；日本萬田酵素；小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16（北京協(xié)和細(xì)胞資源中心）；左旋多巴（L-DOPA）、DCFH-DA、AAPH；四甲基偶氮唑鹽（MTT，Sigma公司）；高糖DMEM培養(yǎng)基（Hyclone公司）；胎牛血清（FBS，杭州四季青生物工程材料有限公司）；0.25%胰蛋白酶、緩沖液PBS、曲拉通X-100（碧云天生物技術(shù)研究所）；二甲基亞砜（DMSO，西隴化工股份有限公司）；NaOH（分析純，北京化工廠）。

1.2 儀器與設(shè)備

BD C 6流式細(xì)胞儀；240 i直熱式二氧化碳培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermofisher公司）；Spectra MR多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)Dynex公司）；恒溫水浴鍋（蘇州珀西瓦爾實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；ESCO AC 2-6 S 1生物安全柜（新加坡藝思高科技有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)

用含體積分?jǐn)?shù)1%雙抗和10% FBS的高糖DMEM完全培養(yǎng)基，在37 ℃、5% CO2的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)B16細(xì)胞，待細(xì)胞長(zhǎng)滿后，按1︰3進(jìn)行傳代。

1.3.2 果蔬酵素對(duì)B16細(xì)胞增殖的影響

選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期及生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞，用胰酶將其消化，調(diào)整細(xì)胞密度為105CFU/mL，按100 μ L/孔接入96孔板中。24 h細(xì)胞貼壁后，換上含有果蔬酵素樣品的DMEM不完全培養(yǎng)基，將試驗(yàn)分為空白組和樣品組，培養(yǎng)48 h后，棄掉培養(yǎng)液，PBS清洗，MTT法測(cè)定增殖率。增殖率用樣品組的吸光度占空白組的吸光度表示。

1.3.3 果蔬酵素對(duì)B16細(xì)胞酪氨酸酶活性的影響

參照劉朝圣等[5]的方法進(jìn)行測(cè)定，各組細(xì)胞及上樣情況同1.3.2，將細(xì)胞分為空白組和樣品組。樣品作用48 h后，棄上清液，PBS清洗，每孔加入100 μL 0.1%的曲拉通X-100溶液，振蕩5 min，細(xì)胞完全裂解后加入50 μL 0.1%/孔的L-DOPA溶液，于37 ℃反應(yīng)30 min后，酶標(biāo)儀檢測(cè)475 nm處的吸光度，結(jié)果以酪氨酸酶激活率表示。

1.3.4 果蔬酵素對(duì)B16細(xì)胞黑色素含量的影響[6]

將細(xì)胞密度調(diào)整為105CFU/mL，按2 mL/孔接入6孔板中，24 h后換上含樣的不完全培養(yǎng)基，將細(xì)胞分為空白組和樣品組，培養(yǎng)48 h。棄上清液，PBS清洗，用胰酶將細(xì)胞消化，NaOH裂解法測(cè)定胞內(nèi)黑色素含量，黑色素含量用樣品組的吸光度占空白組的吸光度表示。

1.3.5 果蔬酵素對(duì)B16細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響

測(cè)定細(xì)胞內(nèi)活性氧水平參考尹曼等[1]的方法，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)胞內(nèi)ROS含量，結(jié)果以ROS相對(duì)產(chǎn)生率來表示對(duì)細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用Origin 8.5統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，試驗(yàn)結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（mean±SD）表示。采用組間t檢驗(yàn)，p＜0.05具有顯著性差異，p＜0.01具有極顯著性差異。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 3種果蔬酵素對(duì)細(xì)胞增殖的影響

3種果蔬酵素對(duì)B16細(xì)胞增殖的影響結(jié)果見圖1。在9個(gè)濃度下，3種果蔬酵素對(duì)B16細(xì)胞均無顯著毒性，可利用這3種酵素及其濃度進(jìn)行后續(xù)相關(guān)試驗(yàn)操作，評(píng)價(jià)其美白作用。

圖1 3種果蔬酵素對(duì)B16細(xì)胞增殖的影響

2.2 3種果蔬酵素對(duì)細(xì)胞酪氨酸酶活的影響

3種果蔬酵素對(duì)B16細(xì)胞酪氨酸酶活的影響結(jié)果見圖2。3種果蔬酵素在試驗(yàn)的所有濃度下對(duì)B16細(xì)胞酪氨酸酶的活性均有抑制作用。在寧夏果蔬酵素中，除稀釋倍數(shù)為10和107濃度，其余各濃度對(duì)酪氨酸酶活具有極顯著的抑制作用（p＜0.01），且在原液和稀釋倍數(shù)為2的濃度下酶激活率最低。在臺(tái)灣酵素中，除稀釋倍數(shù)為102，103和104濃度，其余各濃度對(duì)酪氨酸酶活具有極顯著的抑制作用（p＜0.01），在原液和稀釋倍數(shù)為2的濃度下酶激活率最低。在日本酵素中，除稀釋倍數(shù)為103和104這2個(gè)濃度，其余各濃度對(duì)酪氨酸酶的活性具有極顯著的抑制作用（p＜0.01），在稀釋倍數(shù)為10和102濃度下酶激活率最低。在原液濃度下，臺(tái)灣和日本蔬酵素的酪氨酸酶激活率分別為0.75和0.84，寧夏果蔬酵素為0.55，相較于其他2種酵素，分別降低0.20和0.29。相較于其他2種酵素的酪氨酸酶激活率的最低值，寧夏果蔬酵素酶激活率最低，抑制酶的活性作用更強(qiáng)。

圖2 3種果蔬酵素對(duì)B16細(xì)胞酪氨酸酶活的影響

2.3 3種果蔬酵素對(duì)細(xì)胞黑色素含量的影響

3種果蔬酵素對(duì)B16細(xì)胞黑色素含量的影響結(jié)果見圖3。3種酵素對(duì)B16細(xì)胞的黑色素含量有一定的抑制作用。在寧夏果蔬酵素中，在稀釋倍數(shù)為103，104和1053個(gè)濃度下，能顯著減少黑色素的產(chǎn)生量（p＜0.05）。在臺(tái)灣酵素中，在稀釋倍數(shù)10的濃度下能顯著減少黑色素含量（p＜0.05）。在日本酵素中，稀釋倍數(shù)為10和1022個(gè)濃度下能顯著減少黑色素含量。在稀釋倍數(shù)103濃度下，臺(tái)灣和日本蔬酵素的黑色素含量分別1.00和0.97，寧夏果蔬酵素為0.90，相較于其他2種酵素，分別降低0.10和0.07。結(jié)合3種果蔬酵素對(duì)B16細(xì)胞酪氨酸酶活的影響結(jié)果，寧夏酵素的美白效果更明顯。

圖3 3種果蔬酵素對(duì)B16細(xì)胞黑色素含量的影響

2.4 3種果蔬酵素對(duì)細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響

3種果蔬酵素對(duì)B16細(xì)胞胞內(nèi)ROS產(chǎn)生量的影響見圖4。3種酵素能降低B16細(xì)胞胞內(nèi)ROS相對(duì)產(chǎn)生率。在寧夏酵素中，除稀釋倍數(shù)為10和105濃度，其余各組均能顯著降低ROS產(chǎn)生量（p＜0.05）。在臺(tái)灣酵素中，除稀釋倍數(shù)為10，105，106和107濃度，其余各組均能顯著降低ROS產(chǎn)生量（p＜0.05）。在日本酵素中，少部分濃度能顯著降低ROS產(chǎn)生量。在稀釋倍數(shù)為102濃度下，臺(tái)灣和日本蔬酵素的ROS相對(duì)產(chǎn)生率分別0.86和0.90，寧夏果蔬酵素為0.60，相較于其他2種酵素，分別降低0.26和0.30，說明寧夏酵素具有更好的抗氧化能力。

圖4 3種果蔬酵素對(duì)B16細(xì)胞胞內(nèi)ROS產(chǎn)生量的影響

3 結(jié)論

黑色素在黑色素細(xì)胞中的小型囊泡——黑素小體中合成并包裹轉(zhuǎn)運(yùn)至角質(zhì)細(xì)胞，攝取黑色素并顯色的角質(zhì)細(xì)胞會(huì)向皮膚角質(zhì)層上移，形成最終膚色[7]。美白功效的作用機(jī)制主要包括抑制酪氨酸酶活性，限制黑色素從黑素小體到角質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，清除自由基等[8-9]。當(dāng)前主要是對(duì)酪氨酸酶活性和黑色素含量進(jìn)行研究進(jìn)而評(píng)價(jià)產(chǎn)品美白效果，而常用的評(píng)價(jià)模型有細(xì)胞模型、動(dòng)物模型等。試驗(yàn)采用B16細(xì)胞模型對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行美白功效的評(píng)價(jià)，B16細(xì)胞來源于高度轉(zhuǎn)移能力的鼠皮膚黑色素瘤，其基因組成與人表皮黑素細(xì)胞有較高的相似性，且較后者更易培養(yǎng)，是測(cè)試受試物對(duì)黑素細(xì)胞生物學(xué)功能影響的首選細(xì)胞模型[10]。結(jié)果表明，3種酵素對(duì)B16細(xì)胞均無毒性，且有美白作用，寧夏果蔬酵素的效果更明顯，在適當(dāng)濃度下能顯著抑制酪氨酸酶活，降低胞內(nèi)黑色素的含量，清除胞內(nèi)ROS，提高抗氧化能力，為相關(guān)產(chǎn)品的后續(xù)研發(fā)奠定基礎(chǔ)并提供試驗(yàn)依據(jù)。