徐小博，任敏，何松林，賈文慶*，趙坤，劉會超

1. 新鄉(xiāng)學(xué)院生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院（新鄉(xiāng) 453003）；2. 河南科技學(xué)院園藝園林學(xué)院（新鄉(xiāng) 453003）；3. 河南科技學(xué)院動物科技學(xué)院（新鄉(xiāng) 453003）

紫花地?。╒iola yedoensis Makino）為堇菜科植物紫花地丁的干燥全草，味苦、辛，性寒，歸心、肝經(jīng)，具有清熱解毒、涼血消腫的功效，用于治療黃疸內(nèi)熱、疔瘡腫毒、喉痹腫痛等疾病[1-3]，具有重要的食用、藥用價(jià)值和觀賞價(jià)值?，F(xiàn)代藥理研究表明，其具有抗菌、抗炎、抗HIV、抗凝血、調(diào)節(jié)免疫等作用[4-6]。臨床上多應(yīng)用于治療痢疾、黃疸、咽炎、乳房炎和組織炎等多種病癥[7-8]。香豆素類、黃酮類以及有機(jī)酸是紫花地丁最為重要的活性成分[9-12]。

目前，對紫花地丁藥理性和化學(xué)成分研究較多，而對其主要成分進(jìn)行定量分析較少。僅有高意等[13]、陳胡蘭等[14]、孟繁姝等[15]利用高效液相法分別測定了紫花地丁中秦皮乙素、槲皮素、芹菜素和木犀草素的含量。目前，利用高效液相色譜法同時(shí)測定紫花地丁中多種黃酮和香豆素活性成分的文獻(xiàn)尚未見報(bào)道。此外，有報(bào)道稱：從紫花地丁水溶性部位中分離鑒定了秦皮甲素[16]，秦皮甲素具有抗炎、抗菌、抗血凝、抗腫瘤等重要功能[17]，在前期試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)紫花地丁中秦皮甲素含量也較高，但紫花地丁中秦皮甲素的定量分析尚未見報(bào)道。該研究利用高效液相色譜法對紫花地丁全株和花器官中6種黃酮和香豆素類化合物的含量進(jìn)行測定，為紫花地丁品質(zhì)控制和評估提供新的參考依據(jù)，也為紫花地丁應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、化妝品提供參考。

1 儀器與材料

1.1 材料與試劑

紫花地丁全草于2017年5月采于河南科技學(xué)院花卉基地，紫花地丁的花于2017年4月采于河南科技學(xué)院花卉基地，經(jīng)賈文慶副教授鑒定為紫花地丁V.yedoensis。樣品自然陰干，粉碎后過40目篩，于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試劑與設(shè)備

秦皮甲素對照品（批號110885-200102）、秦皮乙素對照品（批號110753-201716）、蘆丁對照品（批號111720-169050）、木犀草素對照品（批號110875-128789）、柚皮素（批號110875-393138）和木犀草苷對照品（批號111720-201609），百靈威科技有限公司；甲醇和乙腈，均為色譜純，美國Fisher有限公司；試驗(yàn)用水為超純水，其他試劑均為分析純。

LC-20 A高效液相色譜儀（日本島津公司）；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；RE-3000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；十萬分之一天平（梅特勒）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為Inertsil ODS-3 C18（5 μ m，250 mm×4.6 mm）；流動相：以乙腈流動相為A，以15 mmol/L醋酸銨水溶液為流動相B。梯度洗脫：0～10 min，流動相A 10%～25%；10～20 min，流動相A 25%～60%。流量，1 mL/min；進(jìn)樣量，10 μL；柱溫，30 ℃；檢測波長，290 nm?；旌蠈φ掌飞V圖見圖1。

2.2 對照品溶液的制備

分別精密稱取5 mg秦皮甲素、5 mg秦皮乙素、5 mg蘆丁、5 mg木犀草苷、5 mg木犀草素、2.5 mg柚皮素，加入60%甲醇溶解并定容于10 mL容量瓶，混勻。制成質(zhì)量濃度分別為500，500，500，500，500和250 μg/mL對照品溶液。分別準(zhǔn)確量取2.0，2.0，1.0，1.0，1.0和1.0 mL 6種對照品溶液于10 mL容量瓶中，甲醇稀釋至刻度，得到混合對照品溶液，置于4℃冰箱中避光保存。

2.3 供試品溶液的制備

精準(zhǔn)稱量0.5 g樣品粉末，加入50 mL提取溶劑（70%乙醇）。超聲（功率250 W，頻率35 kHz）提取40 min，重復(fù)提取操作3次，將3次的提取液合并。提取液在50 ℃下減壓濃縮，濃縮液用超純水定容到25 mL，避光置于4 ℃冰箱待用。進(jìn)樣前用0.45 μm的濾膜過濾。

2.4 線性關(guān)系的考察

8個(gè)濃度級別的對照品混合液按2.1方法檢測。以樣品濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，得到6個(gè)化合物的線性回歸方程?；貧w方程及線性范圍見表1。結(jié)果表明：各對照品在各自濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖1 混合對照品色譜圖

表1 6種化合物的線性關(guān)系考察結(jié)果

2.5 精密度試驗(yàn)

取2.2混合對照品溶液，以10 μL進(jìn)樣量，連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算得秦皮甲素、秦皮乙素、蘆丁、木犀草苷、木犀草素、柚皮素峰面積的RSD，分別為2.22%，0.67%，1.63%，1.28%，0.77%和1.67%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取紫花地丁樣品，按2.3制備供試品溶液，分別在0，2，4，8，12和24 h進(jìn)樣，按2.1方法測定峰面積，結(jié)果顯示秦皮甲素、秦皮乙素、蘆丁、木犀草苷、木犀草素、柚皮素峰面積的RSD分別為0.77%，1.64%，0.84%，0.89%，1.94%和0.66%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批紫花地丁全株樣品，精密稱取6份1.0 g的樣品，按2.3方法制備供試品溶液，按2.1方法測定樣品中秦皮甲素、秦皮乙素、蘆丁、木犀草苷、木犀草素、柚皮素的含量，測得6個(gè)化合物含量的RSD分別為0.38%，0.46%，1.05%，1.34%，1.21%和0.92%，表明重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取0.5 g紫花地丁樣品6份，分別按表2添加低濃度、中濃度、高濃度的6種對照品，然后制備紫花地丁的提取液，得到分析峰面積后算出加標(biāo)回收率，見表2。6個(gè)化合物的加標(biāo)回收率介于91.18%～99.92%的范圍內(nèi)。

表2 紫花地丁中6種化合物的回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.9 樣品測定

取紫花地丁全株和花器官樣品，按2.3方法制備供試品溶液，按2.1色譜條件測定，利用回歸方程計(jì)算出紫花地丁全株樣品中秦皮甲素、秦皮乙素、蘆丁、木犀草苷、木犀草素、柚皮素的含量，分別為2 406，2 961，887，1 371，382和165 mg/kg，花器官中秦皮甲素、秦皮乙素、蘆丁、木犀草苷、木犀草素、柚皮素的含量分別為4 345，5 665，587，871，582和465 mg/kg。

圖2 紫花地丁全株（A）和花（B）的液相色譜圖

3 結(jié)論與討論

比較了甲醇-磷酸緩沖液、甲醇-醋酸銨緩沖液、乙腈-磷酸緩沖液、乙腈-醋酸銨緩沖液系統(tǒng)的分離效果，考察被測組分與雜質(zhì)峰的分離情況及信號響應(yīng)，最終優(yōu)化流動相為乙腈和15 mmol/L醋酸銨水溶液梯度洗脫，可使各成分達(dá)到理想的分離，且峰形較好，基線平穩(wěn)。

關(guān)于檢測波長的選擇，藥典中蘆丁的檢測波長為260 nm，木犀草素和芹菜素在270和350 nm有最大吸收，周桂芬等[18]選擇用290 nm檢測鐵皮石斛中的柚皮素含量，該試驗(yàn)前期比較270，290，310和330 nm波長對樣品的檢測。結(jié)果表明：當(dāng)波長為290 nm時(shí)，各組分均有較強(qiáng)的吸收強(qiáng)度，故試驗(yàn)最終選擇以290 nm為試驗(yàn)最佳波長條件。

該研究建立HPLC同時(shí)測定紫花地丁全株和花器官中秦皮甲素、秦皮乙素、蘆丁、木犀草苷、木犀草素、柚皮素含量的檢測方法，該方法操作簡便，專屬性強(qiáng)，可為紫花地丁的品質(zhì)評價(jià)提供依據(jù)。

通過對樣品的檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)紫花地丁全株樣品中秦皮甲素、秦皮乙素、蘆丁、木犀草苷、木犀草素、柚皮素的含量分別為2 106，2 961，887，1 371，382和165 mg/g，兩種香豆素含量高于四種黃酮含量，四種黃酮中木犀草苷的含量最高；紫花地丁花器官種中秦皮甲素、秦皮乙素、蘆丁、木犀草苷、木犀草素、柚皮素的含量分別為4 345，5 665，587，871，582和465 mg/g。紫花地丁全株和花器官中秦皮甲素含量雖然均低于秦皮乙素含量，但是高于被檢測4種黃酮的含量。秦皮甲素具有抗炎、抗菌、抗血凝、鎮(zhèn)痛等活性，可抑制大鼠眼晶狀體的醛糖還原酶，是枯草桿菌的生長抑制劑，同時(shí)對化學(xué)性致癌亦有抑制作用[19-20]。因此在利用紫花地丁時(shí)，不能忽視秦皮甲素的作用。花器官中秦皮甲素和秦皮乙素含量均高于全株的，表明花可能具有更高的藥用價(jià)值。