胡鵬飛，陳磊，許贛榮，張薄博

(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，糖化學(xué)與生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫，214122)

牛樟芝(Antrodiacinnamomea，Antrodiacamphorata，Taiwanofunguscamphoratus)是我國(guó)臺(tái)灣特有的珍稀食用與藥用真菌。牛樟芝素有“神芝”、“森林中的紅寶石”之稱[1-2]?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，牛樟芝具有抗癌、保肝、抗炎、抗病毒、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫以及降血脂等多種生物活性。目前，從牛樟芝子實(shí)體及菌絲體中分離得到100多種化合物，主要包括三萜、多糖、泛醌類衍生物以及馬來酸和琥珀酸衍生物等[3-7]。其中，泛醌衍生物是牛樟芝中特有的生物活性物質(zhì)，具有顯著的抗癌活性和較強(qiáng)的抗炎活性。迄今為止，在牛樟芝分離鑒定了12種新的泛醌衍生物，其中包括antroquinonol, antroquinonol B, antroquinonol C, antroquinonol D, antroquinonol L, antroquinonol M, antrocamol LT1, antrocamol LT2, antrocamol LT3, 4-acetyantroquinonol B, 4-acetylantrocamol LT3以及antrocinnamone[8-12]。其中，antroquinonol因其具有極佳的生物活性被國(guó)內(nèi)外學(xué)者廣泛關(guān)注。LEE等[8]研究發(fā)現(xiàn)，antroquinonol對(duì)胰腺癌、肝癌、非小細(xì)胞型肺癌以及阿爾茨海默病等具有顯著的抑制作用[13-20]，目前，antroquinonol已完成了美國(guó)FDA二期臨床實(shí)驗(yàn)[21]，是具有優(yōu)良前景的抗癌化合物。

牛樟芝野生子實(shí)體生長(zhǎng)極其緩慢，且價(jià)格昂貴，無法滿足社會(huì)需求。為了改善野生牛樟芝子實(shí)體供不應(yīng)求的現(xiàn)狀，人們對(duì)牛樟芝的人工培養(yǎng)進(jìn)行了大量研究。目前主要有3種人工培養(yǎng)方式：段木栽培法、固態(tài)發(fā)酵法(包括皿培法)和液態(tài)發(fā)酵法[5, 22]。相對(duì)于液態(tài)發(fā)酵法，固態(tài)發(fā)酵牛樟芝菌絲體中活性成分含量較高、種類較多[23]。相較于段木栽培法，固態(tài)發(fā)酵周期具有時(shí)間更短，生產(chǎn)原料不受限制等優(yōu)點(diǎn)。目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)antroquinonol的研究多集中在藥理活性研究，而對(duì)于通過發(fā)酵條件的優(yōu)化和代謝調(diào)控等方式來提高樟芝菌發(fā)酵中antroquinonol產(chǎn)量的研究卻鮮有報(bào)道。目前，僅有以大米為基質(zhì)進(jìn)行牛樟芝固態(tài)發(fā)酵條件研究的報(bào)道[24-26]，其中路瑞秋等[25]通過對(duì)樟芝菌體的細(xì)胞通透性和代謝進(jìn)行調(diào)控，最終antroquinonol的產(chǎn)量相對(duì)于對(duì)照組提升了232.1%，達(dá)865.3 mg/kg，為目前已有報(bào)道的較高水平。

然而在絲狀真菌的固態(tài)發(fā)酵過程中，有很多因素會(huì)對(duì)菌絲的生長(zhǎng)以及次級(jí)代謝產(chǎn)生較為顯著的影響[27]。其中，固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)作為菌絲生長(zhǎng)的支撐物以及營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)具有很重要的作用[28]。有研究報(bào)道發(fā)現(xiàn)，不同的谷物基質(zhì)對(duì)固態(tài)發(fā)酵的次級(jí)代謝產(chǎn)物的類型以及產(chǎn)量均有影響，其中SRIANTA等[29]研究發(fā)現(xiàn)，不同基質(zhì)上的菌絲生長(zhǎng)以及紅曲色素產(chǎn)量具有很大的差異，其中大米為最適的紅曲色素生產(chǎn)基質(zhì)。TAKESHITA等[30]研究發(fā)現(xiàn)用黑米和貝尼曲所釀造的酒精飲料對(duì)DPPH自由基的清除活性較好。YANG等[31]研究發(fā)現(xiàn)，生長(zhǎng)在燕麥上的牛樟芝菌絲體的甲醇提取物具有更強(qiáng)的抗氧化性。

由此可見，固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)的類型和發(fā)酵條件的篩選能顯著影響絲狀真菌固態(tài)發(fā)酵過程中活性物質(zhì)的合成水平。本研究對(duì)牛樟芝固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)antroquinonol的基質(zhì)進(jìn)行篩選，并對(duì)固態(tài)培養(yǎng)時(shí)間、初始含水量，接種量以及外加氮源等因素進(jìn)行優(yōu)化，在此基礎(chǔ)上結(jié)合響應(yīng)面法對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化篩選。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛樟芝菌，本研究室保藏菌種。

葡萄糖(純度≥99%)，上海生工。蛋白胨、酵母浸粉、酵母提取物、玉米漿粉、(NH4)2SO4、NaNO3為生化試劑，其他均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

電熱恒溫水浴鍋(C-86)，廣州越秀醫(yī)療器械廠；電熱恒溫培養(yǎng)箱(HH·B11·360)，連云港醫(yī)療器械設(shè)備廠；全溫?fù)u床柜(HYG-A)，太倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；高壓蒸汽滅菌鍋(LDZX-40BI)，上海申安醫(yī)療器械廠；電熱鼓風(fēng)干燥箱(101-1型)，上海博訊醫(yī)療設(shè)備廠；高效液相色譜(1525)，美國(guó)waters公司。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)基條件

牛樟芝菌接種于加富PDA斜面，28 ℃避光培養(yǎng)7 d，4 ℃保藏。

孢子懸浮液制備：利用無菌水將加富PDA斜面表層的孢子洗下，玻璃珠打散后鏡檢，使孢子數(shù)達(dá)到1×106個(gè)/mL。

固態(tài)種子培養(yǎng)：葡萄糖20 g/L，玉米漿粉12 g/L，大豆水解液35 mL/L，MgSO4·7H2O 1 g/L，K2HPO40.5 g/L，檸檬酸0.5 g/L，pH自然，500 mL三角瓶中裝120 mL培養(yǎng)基，121 ℃滅菌20 min，接種量為10 mL，28 ℃，130 r/min下培養(yǎng)3 d。

固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)：谷物類物質(zhì)100 g，大豆水解液60 mL/L，KH2PO40.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，初始pH自然，121 ℃滅菌30 min，培養(yǎng)基初始含水量50%，按照體積分?jǐn)?shù)15%進(jìn)行接種，28 ℃下培養(yǎng)30 d。

大豆水解液制備：稱取大豆100 g，清水浸泡24 h，用豆?jié){機(jī)將浸泡后的大豆打磨粉碎后加水定容至1 L，再加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的酶活力為2～3萬的中性蛋白酶，50 ℃水浴4 h充分水解后制成質(zhì)量濃度為100 g/L的大豆水解液(含氮量為6.97%)。

1.3.2 培養(yǎng)條件的優(yōu)化

在初始固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，探討了谷物類型、發(fā)酵時(shí)間、初始含水量、接種量和外加氮源種類及其添加量等發(fā)酵條件對(duì)牛樟芝固態(tài)發(fā)酵antroquinonol產(chǎn)量的影響，為進(jìn)一步的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)確定最佳的取值。

初始含水量/%=

(1)

1.3.3 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素確定的最優(yōu)的谷物類物質(zhì)基礎(chǔ)上，選取氮源添加量X1、初始含水量X2、接種量X3為自變量，antroquinonol產(chǎn)量Y為響應(yīng)值，對(duì)牛樟芝固態(tài)發(fā)酵antroquinonol條件進(jìn)行Box-Behnken試驗(yàn)，設(shè)計(jì)因素如表1所示。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)因素設(shè)計(jì)Table 1 Facters in Box-Behnken experiment

1.3.4 檢測(cè)與分析

1.3.4.1 牛樟芝固態(tài)發(fā)酵干物質(zhì)損失的測(cè)定

研究發(fā)現(xiàn)，在固態(tài)發(fā)酵中干物質(zhì)的損失與單位面積內(nèi)生物量具有高度的相關(guān)性，因此可用干物質(zhì)的損失代替生物量的變化[32-33]。將發(fā)酵所得牛樟芝固態(tài)谷物類物質(zhì)在45 ℃烘箱中烘干至恒重并稱重，測(cè)定最終含水量并計(jì)算干物質(zhì)損失量[34]。

(2)

1.3.4.2 牛樟芝固態(tài)發(fā)酵antroquinonol的測(cè)定

用粉碎機(jī)將烘干的谷物類物質(zhì)打磨成粉末狀，在50 mL比色管中按照料液比1∶20(g∶mL)添加95%乙醇并于50 ℃水浴鍋中振蕩萃取90 min后取出，上下振蕩2～3次，冷卻至室溫后取5 mL用0.22 μm有機(jī)微孔濾膜過濾，進(jìn)行HPLC分析[35]。

1.3.4.3 antroquinonol標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定

準(zhǔn)確稱取1mg antroquinonol標(biāo)準(zhǔn)品(由本實(shí)驗(yàn)室自制，純度≥95%)用乙腈溶解配制為質(zhì)量濃度1 g/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，將其稀釋為質(zhì)量濃度20、40、60、800、100 mg/L的溶液進(jìn)行HPLC檢測(cè)，以antroquinonol濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4.4 不同基質(zhì)顆粒度測(cè)定

隨機(jī)選取至少25顆基質(zhì)排列成一排，用游標(biāo)卡尺測(cè)定，重復(fù)3次，算出不同基質(zhì)的顆粒度。

1.3.4.5 大米直鏈淀粉含量測(cè)定

參照段傳玲等[36]的方法利用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行直鏈淀粉含量測(cè)定。

1.3.4.6 數(shù)據(jù)分析

Box-Behnken設(shè)計(jì)響應(yīng)值按照二次多項(xiàng)式回歸方程模型進(jìn)行回歸分析[37]

(3)

式中:Y為響應(yīng)預(yù)測(cè)值；xi為自變量；β0為截距；βi為線性系數(shù)；βii為平方系數(shù)；βij為交互作用系數(shù)[38]。所有數(shù)據(jù)均使用Design-expert 8.06統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行回歸方差分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 牛樟芝固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)antroquinonol基質(zhì)篩選

如圖1所示，在不同的谷物類物質(zhì)上，牛樟芝產(chǎn)antroquinonol的能力有明顯差異，相比于其他的谷物類物質(zhì)，最適的谷物類基質(zhì)為小米，antroquinonol的產(chǎn)量達(dá)325.0 mg/kg，而以金龍魚粳米作為固態(tài)基質(zhì)時(shí)antroquinonol產(chǎn)量最低，僅有29.6 mg/kg。有文獻(xiàn)報(bào)道，除了谷物類基質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)成分不同之外，在固態(tài)發(fā)酵過程中基質(zhì)的顆粒度對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果也會(huì)有顯著的影響，顆粒較小導(dǎo)致培養(yǎng)基在培養(yǎng)過程中容易結(jié)團(tuán)，顆粒較大會(huì)影響菌體對(duì)內(nèi)部營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的利用[39]。如圖1所示，在不同米的類型中，小米的顆粒度最小，其次為泰國(guó)香米，其余的4種稻米顆粒度相對(duì)于這2種都較大，而antroquinonol產(chǎn)量也較低。同種類型的基質(zhì)中，去皮小麥的顆粒度大于未去皮小麥顆粒度，因此，未去皮小麥中antroquinonol產(chǎn)量高于去皮小麥。但顆粒度與antroquinonol產(chǎn)量關(guān)系也存在特殊情況，如圖1所示，玉米粒是顆粒度最小的一種谷物類物質(zhì)，但其antroquinonol產(chǎn)量不是最高的，觀察其發(fā)酵過程可知，由于其顆粒度過小因而發(fā)酵過程中結(jié)團(tuán)較為嚴(yán)重，因此不適合牛樟芝高產(chǎn)antroquinonol。當(dāng)用黃豆渣作為固態(tài)基質(zhì)的發(fā)酵過程中發(fā)現(xiàn)，因其吸水性極強(qiáng)，基質(zhì)結(jié)團(tuán)十分嚴(yán)重，導(dǎo)致牛樟芝菌絲幾乎無法生長(zhǎng)，因此也幾乎無法檢測(cè)到antroquinonol。另有研究表明，除了顆粒度因素之外，稻米中直鏈淀粉的含量與米的硬度、黏度以及彈性等均具有密切的關(guān)系，直鏈淀粉含量越高，米粒越硬，黏性越小，米粒干燥而蓬松，色澤灰暗，相反，直鏈淀粉含量越低，米粒軟糯，黏度較大,容易結(jié)團(tuán)[40]。結(jié)合圖1的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)選取幾種秈米，粳米和小米進(jìn)行淀粉含量測(cè)定。

圖1 不同固態(tài)基質(zhì)對(duì)牛樟芝固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)antroquinonol的影響Fig.1 Effect of different substrates on the production of antroquinonol in solid-state fermentation of Antrodiacinnamomea

由表2可知，江蘇粳米和金龍魚粳米的直鏈淀粉含量較低，黏度較大，因此antroquinonol產(chǎn)量也相對(duì)較低。而泰國(guó)香米和廣西早稻米的直鏈淀粉含量都相對(duì)較高，這就導(dǎo)致在固態(tài)發(fā)酵過程中米粒硬度較大，營(yíng)養(yǎng)利用不充分，antroiquinonol產(chǎn)量也不高。而小米中直鏈淀粉的含量處于較為適中的水平，antroquinonol的產(chǎn)量相對(duì)較高。除了直鏈淀粉外，也有研究報(bào)道基質(zhì)中的蛋白含量，C/N比以及維生素含量也會(huì)影響絲狀真菌的生長(zhǎng)以及代謝，其中劉愛英等[41]研究發(fā)現(xiàn)，蛋白含量高，C/N比小以及堊白度適中的稻米較適合紅曲菌固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)莫納可林K。

表2 不同米中直鏈淀粉含量對(duì)牛樟芝固態(tài)發(fā)酵的影響Table 2 Effect of amylose content in different kinds of rice in solid-state fermentation of Antrodia cinnamomea

馮衫等[42]研究表明，在固態(tài)基質(zhì)中添加的維生素對(duì)槐耳菌絲生長(zhǎng)具有明顯促進(jìn)作用，但結(jié)合本實(shí)驗(yàn)基質(zhì)篩選發(fā)現(xiàn)，稻米中只有小米和泰國(guó)香米對(duì)antrqouinonol的產(chǎn)生有明顯促進(jìn)作用，而廣西早稻米、江蘇粳米、南方粳米、金龍魚粳米中antroquinonol的產(chǎn)量要少于玉米渣以及2種小麥，這表明不同蛋白以及維生素含量可能也是影響菌體生長(zhǎng)和antroquinonol產(chǎn)生的重要因素。因此，選用小米作為最佳的固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 牛樟芝固態(tài)發(fā)酵時(shí)間對(duì)antroquinonol產(chǎn)量的影響

本文在以小米為固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)的基礎(chǔ)上對(duì)牛樟芝發(fā)酵的周期進(jìn)行確定。由圖2所示，隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，基質(zhì)干物質(zhì)的損失在不斷增加，而在第17天時(shí)，固態(tài)基質(zhì)的消耗速率變慢，說明菌絲生長(zhǎng)進(jìn)入了穩(wěn)定期。相比于干物質(zhì)消耗，antroquinonol在第12天開始合成，到第25天時(shí)產(chǎn)量達(dá)到最大，隨后隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，antroquinonol的產(chǎn)量有所下降。因此，選取最佳發(fā)酵時(shí)間為25 d，antroquinonol產(chǎn)量為372.6 mg/kg。

圖2 發(fā)酵時(shí)間對(duì)牛樟芝固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)antroquinonol的影響Fig.2 Effect of fermentation time on the production of antroquinonol in solid-state fermentation of Antrodiacinnamomea

2.3 接種量對(duì)牛樟芝固態(tài)發(fā)酵antroquinonol產(chǎn)量的影響

在固態(tài)發(fā)酵過程中，接種量會(huì)對(duì)菌絲的生長(zhǎng)和代謝產(chǎn)物的合成有著顯著的影響[43]。因此后續(xù)選取不同的接種量進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。由圖3所示，隨著接種量的增大，基質(zhì)干物質(zhì)的損失在逐漸增大，而antroquinonol的產(chǎn)量呈先增大后減少趨勢(shì)，這說明當(dāng)接種量超過一定的程度后，大部分的基質(zhì)會(huì)過多地用于牛樟芝菌絲體的生長(zhǎng)而不利于antroquinonol的合成。當(dāng)接種量為20 mL/100g基質(zhì)，antroquinonol的產(chǎn)量最高，可達(dá)952.6 mg/kg。因此，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中以接種量為20 mL/100g基質(zhì)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

圖3 接種量對(duì)牛樟芝固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)antroquinonol的影響Fig.3 Effect of inoculation amount on production on antroquinonol in solid-state fermentation ofAntrodia cinnamomea

2.4 固態(tài)發(fā)酵初始含水量對(duì)牛樟芝固態(tài)發(fā)酵antroquinonol產(chǎn)量的影響

初始含水量過高或者過低均不利于菌絲生長(zhǎng)以及次級(jí)代謝的正常進(jìn)行[44-45]。如圖4所示，當(dāng)初始含水量在40%時(shí)，antroquinonol的產(chǎn)量最高，可達(dá)1 318.1 mg/kg，而當(dāng)初始含水量進(jìn)一步增加或者減少時(shí)均不利于antroquinonol的生產(chǎn)。結(jié)合干物質(zhì)損失分析發(fā)現(xiàn)，當(dāng)含水量過高時(shí)，小米結(jié)團(tuán)嚴(yán)重，導(dǎo)致基質(zhì)間的氧傳遞不足，菌絲無法深入基質(zhì)內(nèi)部生長(zhǎng)，因此，小米的消耗降低，營(yíng)養(yǎng)利用不充分，而當(dāng)含水量過低時(shí)，雖基質(zhì)松散，但因小米本身比較硬，也不利于牛樟芝菌絲的生長(zhǎng)。因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇40%作為最佳的初始含水量。

圖4 初始含水量對(duì)牛樟芝固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)antroquinonol的影響Fig.4 Effect of initial moisture content on production on Antroquinonol in solid-state fermentation ofAntrodia cinnamomea

2.5 外加氮源對(duì)牛樟芝固態(tài)發(fā)酵antroquinonol產(chǎn)量的影響

在微生物生長(zhǎng)過程中，合適的碳氮源是必不可少的，在固態(tài)發(fā)酵過程中，固態(tài)基質(zhì)可為其提供充足的碳源，而多數(shù)情形下，外加氮源可有效地促進(jìn)菌體的生長(zhǎng)和代謝產(chǎn)物的合成[46]。因此，在上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，對(duì)外加氮源進(jìn)行篩選和優(yōu)化。實(shí)驗(yàn)過程中選取了6種氮源，其中有機(jī)氮源4種：酵母蛋白胨，酵母粉浸膏，大豆水解液,安琪酵母粉;無機(jī)氮源2種：硫酸銨，硝酸鈉。如圖5所示，在不同氮源的條件下，牛樟芝固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)antroquinonol的能力有著顯著的差異。

A-F分別為：酵母蛋白胨、酵母粉浸膏、大豆水解液、硫酸銨、安琪酵母粉、硝酸鈉圖5 不同氮源對(duì)牛樟芝固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)antroquinonol的影響Fig.5 Effect of different nitrogen sources on production on antroquinonol in solid-state fermentation ofAntrodia cinnamomea

相比于其他幾種氮源，大豆水解液中含有大量的水解大豆肽以及氨基酸等，更容易被吸收利用[47-48]，因此以大豆水解液為氮源的固態(tài)發(fā)酵過程中，干物質(zhì)的損失以及antroquinonol的產(chǎn)量相比于其他幾種氮源要高，說明大豆水解液不僅僅能夠很好的促進(jìn)牛樟芝固態(tài)基質(zhì)上菌絲的生長(zhǎng)而且可以促進(jìn)antroquinonol的合成，在此條件下，固態(tài)發(fā)酵結(jié)束后antroquinonol產(chǎn)量約為1194.9 mg/kg。因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)以大豆水解液為最佳氮源。

2.6 外加氮源含量對(duì)牛樟芝固態(tài)發(fā)酵antroquinonol產(chǎn)量的影響

在上述實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，對(duì)大豆水解液的添加量進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果如圖6所示。

圖6 氮源含量對(duì)牛樟芝固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)antroquinonol的影響Fig.6 Effect of nitrogen source on production on antroquinonol in solid-state fermentation ofAntrodia cinnamomea

發(fā)現(xiàn)當(dāng)大豆水解液含量為80 mL/L時(shí)，固態(tài)發(fā)酵牛樟芝菌絲體產(chǎn)antroquinonol的能力最好，最終產(chǎn)量為1 395.8 mg/kg，是未優(yōu)化的小米固態(tài)發(fā)酵對(duì)照組的4.3倍。

2.7 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果及分析

根據(jù)單因素優(yōu)化結(jié)果，選取外加氮源量(X1),基質(zhì)初始含水量(X2)以及接種量(X3)為主要影響因素，根據(jù)3因素3水平設(shè)計(jì)17個(gè)實(shí)驗(yàn)水平，具體如表3所示。

表3 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)和實(shí)驗(yàn)結(jié)果表3 Box-Behnken design matrix along with theexperimental values of antroquinonol

注：a:3次實(shí)驗(yàn)平均值；b:偏差(%)=(預(yù)測(cè)值-實(shí)驗(yàn)值)×100/實(shí)驗(yàn)值

運(yùn)用Design-expert 8.0對(duì)表3的數(shù)據(jù)進(jìn)行二次回歸擬合，Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)數(shù)據(jù)回歸分析結(jié)果見表4。軟件擬合牛樟芝固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)antroquinonol回歸方程如下:

表4 Antroquinonol產(chǎn)量回歸方程方差分析Table 4 Analysis of variance for the antroquinonolregression model

注：***：P<0.001 差異極顯著; **：P<0.01 差異高度顯著;*：P<0.05 差異顯著

通過軟件Design Expert 8.06軟件求解方程得出，預(yù)測(cè)的最優(yōu)條件為X1=0.12，X2=0.2，X3=0.18，即當(dāng)?shù)刺砑恿繛?2.4 mL/L，初始含水量為41%，接種量20.9%時(shí)，antroquinonol產(chǎn)量最大，預(yù)測(cè)產(chǎn)量為1 336.0 mg/kg?？紤]實(shí)際實(shí)驗(yàn)操作，修正最優(yōu)條件為氮源添加量為82.4 mL/L，初始含水量為41%，接種量21%。為進(jìn)一步驗(yàn)證模型可靠性，采用修正后的條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，測(cè)得antroquinonol的產(chǎn)量為1 340.7 mg/kg(為3組重復(fù)所得平均值)，相對(duì)于預(yù)測(cè)值而言，實(shí)際值偏差-0.4%，二者基本吻合，因此該優(yōu)化模型可靠。實(shí)驗(yàn)結(jié)果是未優(yōu)化前(325.0 mg/kg)的4.1倍。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以牛樟芝中具有顯著生理活性的antroquinonol為目標(biāo)產(chǎn)物，應(yīng)用響應(yīng)面分析法探究了在以小米為基質(zhì)的牛樟芝固態(tài)發(fā)酵過程中不同因素對(duì)antroquinonol產(chǎn)量的影響。首先，通過單因素實(shí)驗(yàn)，確定了發(fā)酵周期、初始含水量、接種量以及氮源類型和添加量均會(huì)對(duì)antroquinonol的產(chǎn)量有顯著影響。其次，在此基礎(chǔ)上，采用3因素3水平的Box-Benhnken中心組合實(shí)驗(yàn)原理設(shè)計(jì)響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)，得到最佳的發(fā)酵條件為：小米100 g，大豆水解液82.4 mL/L，初始含水量41%，接種量21 mL/100 g基質(zhì)，發(fā)酵25 d。在此條件下，牛樟芝固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)antroquinonol為1 340.7 mg/kg，是未優(yōu)化前(325.0 mg/kg)的4.1倍，為目前已有文獻(xiàn)報(bào)道中的最高水平。