鐘 瑜，朱蕓蕓，韓文倫

(浙江省立同德醫(yī)院，浙江 杭州310013)

慢性腎臟病(CKD)是威脅世界公共健康的主要疾病之一[1]。研究發(fā)現(xiàn)腎小管間質(zhì)纖維化是導(dǎo)致腎功能衰竭的關(guān)鍵因素[1]。學(xué)者發(fā)現(xiàn)構(gòu)建抗腎間質(zhì)纖維化的蛋白質(zhì)，能增加其表達調(diào)控腎間質(zhì)纖維化機制[2]。本研究針對BMP-4表達通過miRNA-21促進腎細胞侵襲的機制研究。

一、材料與研究方法

1.一般資料。選擇2005年1月至2017年12月我院腎內(nèi)科接診的90例腎纖維化患者石蠟切片，所有病例均經(jīng)病理學(xué)證實，本研究患者知情并同意，且我院倫理委員會審批通過。

2.方法。(1)原代培養(yǎng)： 所選研究腎病纖維化患者邊緣組織，在消毒液中標本進行初步處理，原代培養(yǎng)。采用酶消化法進行元代培養(yǎng)，將組織剪成1mm2碎塊置于標本消化液中，后移至容量為50mL的無菌管中，加入消化液值15mL，于恒溫搖床中反應(yīng)2h。離心機離心，取上清液。(2)CAFs與腎纖維化細胞共培養(yǎng)： Trans-well模型，上室加入1×105個腎纖維化細胞(NRK-52E)，下室加入2×105個CAFs和預(yù)先轉(zhuǎn)染MBP-4 siRNA的CAFs,37℃恒溫下培養(yǎng)48h后收集共培養(yǎng)的腎纖維化細胞。(3)siRNA轉(zhuǎn)染： 使用無血清培養(yǎng)基稀釋BMP-4、siRNA-21、miRNA-21，稀釋后與轉(zhuǎn)染劑混合，室溫孵育20分鐘。(4)抑制BMP-4/封閉miRNA-21表達： 6孔板鋪2×105個CAFs腎纖維化細胞，在溫度-37℃下培養(yǎng)24h后，棄上清液，加入無血清培養(yǎng)基(2ml)，每孔中滴入混合物培養(yǎng)24h后收集細胞。(5)高表達BMP-4的CAFs對腫瘤細胞遷移能力和侵襲能力實驗。①細胞遷移能力實驗： 所用模型為Trans-well模型。收集處于對數(shù)生長期的CAFs，先轉(zhuǎn)染BMP-4的CAFs及NRK-52E細胞。調(diào)整細胞濃度至合適值，培養(yǎng)24h后將取下，用乙醇預(yù)冷固定后，進行HE染色。置于顯微鏡下觀察，并分析腎纖維細胞的轉(zhuǎn)移能力改變情況。②細胞侵襲能力實驗： 其他步驟同上上述遷移能力實驗。不同之處為培養(yǎng)時間為48h。(6)BMP-4誘導(dǎo)的侵襲和遷移能力，miRNA-21的作用影響實驗。①侵襲能力影響實驗 ： 用無血清培養(yǎng)基提前調(diào)整好的預(yù)先轉(zhuǎn)染BMP-4腎纖維細胞NRK-52E濃度后，加入到Trans-well模型上室。方法同上。②遷移能力影響實驗： 方法同上。(7)IHC實驗： 用0.01mol/L的枸緣酸鹽修復(fù)液高壓修片3分鐘，然后滴加anti-BMP4和anti-miRNA-21，24小時后。用PBS洗滌三次后滴加二抗，室溫下靜置20分鐘，再用PBS洗滌三次，最后進行顯色，復(fù)染，脫水封片等操作。掃描儀掃描，留存。

3.觀察指標。BMP-4和miRNA-21免疫組化實驗染色結(jié)果判定標準： 陽性細胞評分×染色強度評分。0分無表達，1-3分可以表達，4-6分弱表達，7-12分強表達。

二、結(jié) 果

1.BMP-4高表達的KAFs對腎細胞遷移能力和侵襲能力的影響。腎細胞的遷移和侵襲能力在KAFs共培養(yǎng)后顯著增強，BMP-4的表達受到siRNA抑制后，KAFs對遷移能力和侵襲能力的促進作用得到有效抑制(見圖1、圖2)。

2.BMP-4和miRNA-21免疫組化染色結(jié)果。BMP-4主要在腎間質(zhì)成纖維細胞核中表達，miRNA-21主要在腎纖維細胞膜中表達。90例患者臨床資料、BMP-4和miRNA-21與病理學(xué)參數(shù)的關(guān)系： BMP-4和miRNA-21在腎纖維細胞中的陽性率分別為56.67%(51/90)和43.33%

圖1 KAFs共同培養(yǎng)后腎纖維細胞遷移的能力

圖2 KAFs共同培養(yǎng)后腎纖維細胞侵襲的能力

(39/90)，并且其表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移、TNM分期差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

三、討 論

研究發(fā)現(xiàn)TGF-β信號系統(tǒng)可通過將其特異的SMAD轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白添加到pri-miR-21的復(fù)合物上，從而增強miRNA-21的表達[3]。本項目研究，利用miRNA-21提前封閉腎細胞中siRNA的表達，當其表達受到阻斷后，明顯限制了BMP-4的促腎細胞侵襲轉(zhuǎn)移作用。免疫組化表明，經(jīng)KAFs共培養(yǎng)后腎細胞遷移能力和侵襲能力顯著增強，利用siRNA抑制BMP-4的表達后，KAFs抑制遷移和侵襲能力的效果得到抑制。在腎細胞中BMP-4和miRNA-21陽性率分別為56.67%(51/90)和43.33%(39/90)，BMP-4和miRNA-21表達與遠處轉(zhuǎn)移、TNM、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有較大關(guān)系。

綜上，在KAFs中BMP-4表達通過miRNA-21促進提高腎細胞侵襲遷移能力，為今后腎病的治療和預(yù)后提供參考依據(jù)。