柳丹，湯志明，武福云，趙紅艷，柯鏡，向鵬，金佳晴，李珊，2△

胃癌是世界上死亡率排名第三的常見消化道惡性腫瘤［1］，順鉑（cisplatin，DDP）是目前臨床上使用的最重要的抗癌藥物之一［2-3］。但是，胃癌細胞對DDP耐藥性的產生常可致化療失?。?］。因此，如何提高胃癌細胞對DDP 的敏感度、避免化療耐藥性的產生是目前臨床上亟待解決的問題。程序性細胞凋亡因子4（programmed cell death 4，PDCD4）是近年來新發(fā)現的一類促凋亡基因，筆者前期研究也發(fā)現，過表達PDCD4能夠通過抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表達起到促進宮頸癌細胞凋亡的作用［5］。另有研究發(fā)現，PDCD4 水平和腫瘤化療敏感度有關［6］。但關于PDCD4對胃癌細胞DDP敏感性的影響尚未明確，而PDCD4 的下游調控基因也未完全闡明。本研究通過敲低PDCD4表達水平，探究其是否通過磷酸化蛋白激酶 B（phosphorylated protein kinase B，pPKB/pAKT）/磷酸化糖原合成酶激酶 3β（phosphorylated glycogen synthase kinase3β，pGSK3β）信號通路對胃癌細胞DDP耐藥產生影響，以期為胃癌DDP耐藥機制的闡明尋找新的分子靶點，也為診斷胃癌DDP 敏感性提供潛在的標志物。

1 材料與方法

1.1 主要材料 胃癌細胞系SGC-7901 購自中科院上海細胞所；胎牛血清購自杭州四季青公司；DMEM 培養(yǎng)基購自美國Thermo Fisher Scientific 公司；青鏈霉素雙抗購自杭州吉諾公司；抗PDCD4 多克隆抗體（66100）、pAKT（S473）單克隆抗體（66444）聚腺苷酸二磷酸核糖轉移酶（剪切體）［poly ADP-ribose polymerase cleavage，PARP（C）］抗體（13371）購自武漢三鷹技術有限公司，抗pGSK3β（S9）抗體（5558）購自美國CST公司；LY294002（S1737）、wortmannin（S1952）購自上海碧云天生物技術有限公司；PVDF 膜購自美國Millipore 公司；Caspase 3活性檢測試劑盒購自上海貝博公司；M-PER、蛋白酶抑制劑、BCA 檢測試劑盒、ECL 化學發(fā)光檢測試劑盒購自美國Pierce公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞轉染與分組 將胃癌細胞株SGC-7901 培養(yǎng)于DMEM完全培養(yǎng)基，5%CO2、37 ℃、飽和濕度的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。shRNA 購自上海吉瑪公司，shRNA 序列：shRNA scramble control（shNC）5'-GTTCTCCGAACGTGTCACGT-3'；shPDCD4 5'-CTGGACAGGTGTATGATGTGG-3' 。 按 照lipofectamine 3000 說明書（Invitrogen，美國）將ShNC 和Sh-PDCD4質粒轉染至SGC-7901細胞系，再經過G418篩選14 d培養(yǎng)陽性克隆，得到穩(wěn)定敲減表達的細胞系。在2種細胞株中分別通過熒光顯微鏡檢測細胞的轉染效率，利用Realtime RT-PCR 和 Western blot 檢測 PDCD4 的 mRNA 和蛋白質表達水平。將細胞分為sh-NC組（僅穩(wěn)定轉染shNC 質粒）；shPDCD4組（僅穩(wěn)定轉染shPDCD4質粒）；shNC加藥組（轉染shNC 質粒并加入 2.5 mg/L 順鉑處理 12 h）；shPDCD4 加藥組（轉染shPDCD4 質粒并加入順鉑處理）。為了探究Akt 的作用，在細胞中加入特異性Akt抑制劑LY294002和Wortmannin阻斷信號通路12 h，將細胞分為LY294002 阻斷組（轉染shPDCD4質粒，10μmol LY294002預處理12 h再加入順鉑處理）、Wortmannin 阻斷組（轉染shPDCD4 質粒，先加5 μmol Wortmannin預處理4 h再加入順鉑處理）。

1.3 熒光定量PCR 檢測PDCD4 mRNA 表達情況 細胞總RNA的抽提采用TRIzol 法。取2μg總RNA采用反轉錄試劑盒反轉錄為cDNA，采用Bio-Rad 熒光定量PCR 儀，SYBR Green實時熒光定量PCR檢測目的基因mRNA的表達。所用引物見文獻［5］。反應條件：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個循環(huán)，并進行熔解曲線分析。GAPDH作為內參基因，采用2-ΔΔCT方法分析目的基因的相對表達水平。

1.4 Western blot 印跡法檢測PDCD4、pAKT、pGSK3β、PARP（C）蛋白表達情況 用含cocktail 蛋白酶抑制劑的M-PER 裂解液200μL裂解細胞30 min，所有操作均在冰上進行。離心收集上層液體。取部分樣品進行BCA 法定量分析并調整上樣量至 20 μg。SDS-PAGE 電泳后轉膜、封閉，加 PDCD4、pAKT、pGSK3β、PARP（C）與內參蛋白GAPDH 一抗（1∶1 000稀釋），4 ℃環(huán)境下孵育過夜，TBST洗滌后HRP標記的羊抗兔二抗（1∶10 000）室溫孵育1 h，ECL化學發(fā)光檢測試劑盒化學發(fā)光液與PVDF 膜反應，曝光并保存圖片。采用圖像分析軟件Image J 對Western blot 實驗所得結果圖像進行灰度分析，所有結果以GAPDH 為內參對照，結果用灰度比值表示目的蛋白相對表達量。

1.5 Caspase 3活性檢測 采用Caspase 3酶活性的試劑盒結合分光光度法檢測細胞裂解液中Caspase 3 酶活性。操作步驟參照試劑盒說明書。將細胞鋪入96孔板，胰酶消化貼壁細胞，離心收集細胞，PBS 洗滌1次后加入裂解液，冰浴裂解15 min。每孔中加入底物10μL，37 ℃孵育2 h后于405 nm處檢測光密度（OD）值。

1.6 免疫熒光檢測細胞凋亡變化 分組處理結束后收集細胞，吸盡培養(yǎng)液，加入固定液，固定10 min或4 ℃過夜。細胞培養(yǎng)物中加入約1/10 細胞培養(yǎng)基體積Hoechst 染色液，充分覆蓋待染色的樣品。在37 ℃培養(yǎng)細胞10～20 min。PBS洗細胞2次。將樣本置于熒光顯微鏡下觀察細胞核形態(tài)變化，若有細胞核不完整、核固縮、染色質聚集濃染等現象出現，表示細胞出現凋亡。

1.7 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 22.0軟件作統(tǒng)計學處理。符合正態(tài)分布的計量數據用均數±標準差（±s）表示，組間比較采用析因設計2因素2水平的方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 PDCD4 穩(wěn)定敲低表達的SGC-7901 細胞株構建 熒光顯微鏡下可見多數細胞呈現綠色熒光，細胞轉染成功，見圖1。不同質粒轉染和是否加順鉑干預對PDCD4 的mRNA 及蛋白相對表達水平存在交互作用（P＜0.05）；各單獨效應下，shPDCD4組較shNC組PDCD4 的mRNA 和蛋白相對表達水平明顯降低；shPDCD4加藥組較shNC加藥組 PDCD4 的mRNA 和蛋白相對表達水平也顯著減弱（均P＜0.05），見圖2、表1。

2.2 各組 Caspase3 活性比較 shNC組、shPDCD4組、shNC 加藥組、shPDCD4 加藥組 Caspase3 活性水平分別為0.039±0.016、0.037±0.011、0.263±0.024、0.216±0.014（n=3，FA=424.674，FB=6.183，FA×B=5.376，均P＜0.05），其中與shNC 加藥組相比，shPDCD4 加藥組Caspase3活性下降（P＜0.05）。

Fig.1 Transfection effect detected by fluorescence microscope（×200）Fig.1 熒光顯微鏡檢測細胞轉染情況（×200）

Fig.2 Western blot analysis of PDCD4 protein level in deficiency stable cell line of SGC-7901圖2 Western blot 檢測穩(wěn)定轉染SGC-7901細胞株中PDCD4的表達

Tab.1 Relative mRNA and protein expression levels of PDCD4 after SGC-7901 cell transfection表1 SGC-7901細胞轉染后PDCD4 mRNA和蛋白的表達情況 （n=3，±s）

Tab.1 Relative mRNA and protein expression levels of PDCD4 after SGC-7901 cell transfection表1 SGC-7901細胞轉染后PDCD4 mRNA和蛋白的表達情況 （n=3，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；A:不同轉染質粒影響；B：是否加順鉑

組別shNC組shPDCD4組shNC加藥組shPDCD4加藥組PDCD4 蛋白1.02±0.21 0.37±0.04 0.65±0.12 0.41±0.08 36.331＊＊5.291＊7.628＊FA FB FA×B PDCD4 mRNA 1.08±0.08 0.57±0.09 1.32±0.11 0.47±0.09 158.303＊＊1.761 9.681＊

2.3 細胞免疫熒光檢測各組細胞凋亡情況 細胞經過加入Hochest 染料后檢測發(fā)現，shNC 加藥組細胞數目明顯降低，并且一部分細胞核結構出現不完整、核固縮、染色質聚集濃染等現象，而shPDCD4加藥組中細胞數目也有減少，但細胞核形態(tài)未發(fā)生顯著改變，見圖3。

Fig.3 PDCD4 deficiency inhibited apoptosis induced by DDP in gastric cancer cells（×400）圖3 PDCD4表達缺失抑制DDP引起的胃癌細胞凋亡（×400）

2.4 各組PDCD4 表達下調后相關蛋白的表達情況 （1）pAKT 和pGSK3β。不同質粒與加藥間對pAKT 和pGSK3β 蛋白的相對表達水平存在交互作用（P＜0.05）；各單獨效應下，相較于 shNC組，shPDCD4組中 pAKT 和 pGSK3β 的表達量均有明顯增加，而與shNC加藥組相比，shPDCD4加藥組pAKT和pGSK3β 的蛋白表達水平有顯著上調（均P＜0.05），見圖4、表2。（2）PARP（C）、p-GSK3β 及pAKT。不同質粒與加藥對PARP（C）、p-GSK3β 及pAKT蛋白的相對表達水平存在交互作用；各單獨效應下，相較于shPDCD4 加藥組，Wortmannin 阻斷組PARP（C）的蛋白表達水平上調，p-GSK3β 和pAKT蛋白表達水平下調（P＜0.05）；相較于shPDCD4加藥組，LY294002 阻斷組PARP（C）的蛋白表達水平上調，p-GSK3β 和 pAKT 蛋白表達水平下降（P＜0.05），見圖5、表3。

Fig.4 PDCD4 knockdown induced the increased levels of pAkt and phosphorylation of GSK3β圖4 PDCD4表達下調導致pAKT表達升高，GSK3β磷酸化發(fā)生

Tab.2 The relative expression of target protein after PDCD4 knockdown表2 PDCD4表達下調后目的蛋白的相對表達量

Fig.5 PDCD4 knockdown inhibited apoptosis through pAKT/pGSK3β pathway圖5 PDCD4表達下調通過pAKT/pGSK3β途徑抑制細胞凋亡蛋白表達

3 討論

PDCD4蛋白包含兩個重要的α-螺旋，能夠競爭性地結合于真核細胞翻譯起始因子上，從而抑制真核生物蛋白質的合成，進而促進細胞凋亡［7］。研究表明，PDCD4 在多種惡性腫瘤中呈現出低表達，而正常表達或高表達PDCD4 則可通過抑制基因轉錄和翻譯等過程促進腫瘤細胞的凋亡［8］。筆者前期研究發(fā)現，過表達PDCD4將導致抗凋亡蛋白的表達下調，進而促進宮頸癌細胞凋亡的發(fā)生［5］。Caspase 3是一個在細胞凋亡過程中起重要作用的關鍵蛋白酶。Caspase 3 可以直接特異性剪切許多Caspase 底物，是細胞凋亡分子機制的重要組成部分［9］。本研究細胞免疫熒光結果發(fā)現，敲低表達PDCD4將導致DDP引起的細胞凋亡水平下降，表明PDCD4的表達下調可降低細胞對DDP的敏感性，提示著PDCD4可能通過某些信號途徑調控DDP引起的細胞凋亡。

Tab.3 The relative expression of target protein after inhibiting Akt pathway表3 Akt通路阻斷后目的蛋白的相對表達量

細胞凋亡是一個涉及多條信號通路、調控精細復雜的過程。Akt是一種絲/蘇氨酸蛋白激酶，Akt的活化（pAKT）是Akt 信號傳導通路發(fā)揮作用的關鍵。GSK3β 是Akt 活化后的下游靶基因之一，除了可以調控糖代謝，進一步研究發(fā)現GSK3β還可通過磷酸化信號通路蛋白和轉錄因子，從而影響細胞的生存與凋亡［10］。已經有研究表明 pAKT/pGSK3β 信號通路與腫瘤細胞的增殖、生存、凋亡、代謝、侵襲轉移，以及腫瘤耐藥、腫瘤免疫逃逸等密切相關［11］。本研究結果發(fā)現，相較于shNC組，shPDCD4組中pAKT和pGSK3β 的表達量均有明顯增加，而與shNC 加藥組相比，shPDCD4加藥組pAKT和pGSK3β的蛋白表達水平仍有顯著上調，表明敲減PDCD4的表達可增加pAKT和pGSK3β的蛋白表達水平，提示PDCD4表達缺失能夠激活pAKT/pGSK3β信號通路，推斷PDCD4表達缺失抑制細胞凋亡可能是通過激活pAKT/pGSK3β信號通路來實現。

當 Akt 被激活以后，GSK3β N 末端絲氨酸殘基（Ser9-GSK3β）的磷酸化可促進GSK3β的降解，進一步抑制了其本身作為激酶的活性［12］，能夠促進線粒體介導的內源性凋亡［9］。一旦GSK3β 被磷酸化后，腫瘤細胞內源性凋亡出現下降，從而利于腫瘤細胞的存活，因此，GSK3β磷酸化增強有利于腫瘤耐藥的發(fā)生。有研究表明，卵巢癌細胞對DDP 耐藥與pAKT［13］和pGSK3β［14］的活化有密切關系。而且在乳腺癌細胞和肺癌細胞系中，pGSK3β增加可阻礙細胞的凋亡通路，從而導致細胞對多種化療藥物產生耐藥［15］。本研究顯示，相較于shPDCD4加藥組，Wortmannin 阻斷組PARP（C）的蛋白表達水平上調，p-GSK3β和pAKT蛋白表達水平下調；相較于shPDCD4加藥組，LY294002阻斷組PARP（C）的蛋白表達水平上調，p-GSK3β 和pAKT 蛋白表達水平下降，表明當在PDCD4 表達缺失的細胞中加入兩種Akt 抑制劑阻斷該信號通路后，凋亡標志蛋白PARP（C）的表達均重新出現上調趨勢，提示PDCD4 表達缺失所抑制的細胞凋亡依賴于pAKT/pGSK3β 信號通路的活化。

綜上所述，PDCD4 在腫瘤中表達下調或者缺失可激活pAKT/pGSK3β信號通路，從而引起腫瘤耐藥的發(fā)生發(fā)展。PDCD4可作為抑癌基因，一旦在胃癌細胞中表達缺失，將導致胃癌細胞對化療藥物DDP的敏感性下降，促進細胞耐藥的發(fā)生，這將為胃癌的耐藥機制探討提供新的思路與方法，有望為臨床上DDP耐藥敏感性判斷提供新的分子靶標。