成仙葉 錢(qián)雯 金軼 李謝倫 蘇東明 陳斌

1南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚科 210029；2南京醫(yī)科大學(xué)代謝疾病研究中心 210029

紫外線照射可以引起皮膚成纖維細(xì)胞產(chǎn)生大量活性氧（reactive oxygen species，ROS）［1-2］，促發(fā)細(xì)胞內(nèi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ER stress），這一過(guò)程在紫外線誘導(dǎo)的皮膚損傷中發(fā)揮重要作用［3-4］。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通過(guò)激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)蛋白降解（ER-associated degradation，ERAD），促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)未折疊或錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)的降解［5］。羥甲基戊二酰輔酶A還原酶降解蛋白1（Hrd1）是ERAD過(guò)程中一種重要的E3泛素連接酶，可以通過(guò)介導(dǎo)多種蛋白質(zhì)降解，在腎纖維化、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、肝硬化等疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用［6-8］，同時(shí)不少研究證實(shí)，Hrd1是多種抗光老化蛋白質(zhì)［如NF-E2相關(guān)因子2（Nrf2）、胰島素樣生長(zhǎng)因子1受體（IGF-1R）］的特異性E3泛素連接酶，介導(dǎo)其泛素化降解［7，9］。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，紫外線照射可明顯促進(jìn)皮膚成纖維細(xì)胞內(nèi)Hrd1的表達(dá)［10］。為了進(jìn)一步證實(shí)Hrd1是否參與光老化的發(fā)生，我們通過(guò)收集臨床標(biāo)本及建立小鼠光老化模型，進(jìn)一步明確紫外線照射與皮膚Hrd1表達(dá)水平的關(guān)系。全反式維A酸（ATRA）是臨床上公認(rèn)的可治療光老化的外用藥物，其機(jī)制包括抑制激活蛋白-1轉(zhuǎn)錄因子、抑制基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）的表達(dá)及增加真皮膠原纖維量［11］。本研究通過(guò)在動(dòng)物和細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)中加入ATRA處理，觀察ATRA處理后Hrd1的表達(dá)，探索ATRA治療皮膚光損傷的分子機(jī)制。

材料與方法

一、主要試劑與儀器

Hrd1（SYVN1）一抗（兔抗人多克隆抗體，美國(guó)Abcam公司）、PV-6000試劑盒（北京中杉金橋有限公司）、羊抗兔二抗（美國(guó)Thermo公司）、ATRA（R2625，美國(guó)Sigma公司，純度＞98%，用二甲基亞砜溶解配制）、噻唑藍(lán)（MTT）（美國(guó)Sigma公司）、ROS檢測(cè)試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）、Bio-spectra紫外照射系統(tǒng)（法國(guó)Vilber Lourmat公司）、熒光顯微鏡（DP70，日本東京Olympus公司）。清潔級(jí)BALB/c小鼠由上海斯來(lái)克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)SCXK（滬）2007-0005，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)許可證號(hào)220181352。江蘇省疾病控制中心（SPF）動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室喂養(yǎng)，各實(shí)驗(yàn)組小鼠按雌雄分組分開(kāi)，全價(jià)顆粒飼料喂養(yǎng)，飲清潔自來(lái)水，室內(nèi)恒溫22℃。

二、方法

1.臨床標(biāo)本收集：臨床皮膚標(biāo)本來(lái)自2017年12月至2018年6月南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚科患者淺表良性腫物病灶周?chē)Ｆつw，曝光部位皮膚取自面頸部及手腕，避光部位皮膚取自胸背部、大腿及臀部。標(biāo)本取自12例女性，均為室內(nèi)工作者，年齡32～70歲。根據(jù)年齡及部位將標(biāo)本分為4組，每組3份，組1來(lái)自30～40歲曝光部位，組2來(lái)自30～40歲避光部位，組3來(lái)自60～70歲曝光部位，組4來(lái)自60～70歲避光部位。本研究通過(guò)南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（2016-SRFA-033），患者均簽署知情同意書(shū)。

2.動(dòng)物分組及處理：清潔級(jí)BALB/c小鼠（月齡3周，雌雄各20只）隨機(jī)分為對(duì)照組、紫外線組、紫外線+ATRA組、ATRA組，每組4只。造模方法參照文獻(xiàn)［12］，紫外線組、紫外線+ATRA組每日同時(shí)照射UVA 10 J/cm2和UVB 30 mJ/cm2；紫外線+ATRA組（照光前給藥）、ATRA組小鼠在背部剃毛區(qū)每日均勻涂抹1次0.1 ml 0.1%ATRA乳膏（重慶華邦制藥公司）；對(duì)照組不涂藥，不照射紫外線。14周后處死小鼠并取小鼠背部脫毛區(qū)全層皮膚。

3.免疫組化檢測(cè)皮膚中Hrd1表達(dá)：12份人皮膚組織和小鼠皮膚組織標(biāo)本用10%甲醛固定，石蠟包埋、切片、脫蠟，抗原修復(fù)。滴加內(nèi)源性過(guò)氧化物酶阻斷劑，常溫孵育，再滴加Hrd1一抗（濃度1∶200），4℃過(guò)夜，滴加酶標(biāo)羊抗小鼠/兔IgG聚合物，37℃孵育；二氨基聯(lián)苯胺染色液顯色，最后復(fù)染、脫水、透明、封片。使用DP2-BSW軟件分析并采集圖片，用Image J軟件在平均像素強(qiáng)度相同的區(qū)域測(cè)定染色強(qiáng)度即平均光密度值。

4.細(xì)胞分組：取包皮環(huán)切手術(shù)患者的包皮標(biāo)本（患者均簽署知情同意書(shū)），分離培養(yǎng)原代人成纖維細(xì)胞，方法參照文獻(xiàn)［10］。選用4～8代處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞分為對(duì)照組、紫外線組、ATRA+紫外線組及ATRA組。紫外線組和ATRA+紫外線組照光前用PBS覆蓋細(xì)胞上層，照射劑量為10 J/cm2UVA或30 mJ/cm2UVB。ATRA+紫外線組（紫外線照射后）和ATRA組用含1 μmol/L ATRA（濃度參考文獻(xiàn)［13-14］）的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

5.Western印跡法檢測(cè)成纖維細(xì)胞中Hrd1的表達(dá)：將各組人皮膚成纖維細(xì)胞在冰PBS中洗2遍，然后在RIPA裂解緩沖液中溶解。將含有等量蛋白的樣品上樣后進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，將蛋白轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上。室溫下，用5%脫脂奶粉封閉非特異性蛋白1 h。加入Hrd1一抗，-4℃冰箱中過(guò)夜。TBST洗3次，每次5 min，加入過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫下結(jié)合1 h。采用ECL化學(xué)發(fā)光試劑反應(yīng)5 min，利用凝膠自動(dòng)成像儀成像。采用Image J軟件進(jìn)行半定量分析，數(shù)據(jù)表達(dá)為Hrd1蛋白灰度值與內(nèi)參蛋白灰度值的比值。

6.細(xì)胞內(nèi)ROS檢測(cè)：使用ROS檢測(cè)試劑盒檢測(cè)各組人成纖維細(xì)胞內(nèi)ROS水平。將用PBS沖洗處理后的細(xì)胞加入含有10 μmol/L CM-H2DCFDA培養(yǎng)液中37℃孵育30 min，無(wú)血清培養(yǎng)液沖洗3次。通過(guò)測(cè)定2′，7′-二氯熒光素評(píng)估ROS水平。使用熒光顯微鏡觀察2′，7′-二氯熒光素。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié)果

一、Hrd1在人體皮膚的表達(dá)

見(jiàn)圖1。不同年齡段人皮膚標(biāo)本中，均可發(fā)現(xiàn)成纖維細(xì)胞Hrd1的表達(dá)，30～40歲患者曝光部位皮膚組織中Hrd1表達(dá)（0.307±0.256）明顯高于避光部位（0.196±0.330）（t=5.486，P=0.032）；60～70歲患者曝光部位（0.486±0.579）亦明顯高于避光部位（0.199±0.375）（t=10.579，P=0.009）。

二、紫外線及ATRA對(duì)小鼠皮膚中Hrd1表達(dá)的影響

對(duì)照組、紫外線組、紫外線+ATRA組及ATRA組小鼠皮膚中Hrd1蛋白水平分別為0.189±0.015、0.288±0.017、0.187±0.020、0.226±0.021，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=19.553，P＜0.001），紫外線組高于對(duì)照組（t=5.337，P=0.033）和紫外線+ATRA組（t=4.891，P=0.039）。見(jiàn)圖2。

三、紫外線照射及ATRA對(duì)培養(yǎng)的人皮膚成纖維細(xì)胞Hrd1表達(dá)的影響（圖3）

UVA照射時(shí)，對(duì)照組、紫外線組、紫外線+ATRA組及ATRA組人皮膚成纖維細(xì)胞中Hrd1蛋白水平分別為0.183±0.008、0.866±0.082、0.642±0.043、0.265±0.041，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=120.704，P＜0.001），其中紫外線組高于對(duì)照組（t=13.437，P=0.005）和ATRA+紫外線組（t=4.341，P=0.048）。

圖1 免疫組化法檢測(cè)人皮膚組織中Hrd1的表達(dá)曝光部位皮膚中Hrd1較同年齡避光部位的表達(dá)明顯升高（×200），左下角小圖中黑色箭頭處為成纖維細(xì)胞（×400）

圖2 免疫組化法檢測(cè)慢性紫外線照射及外用全反式維A酸（ATRA）對(duì)小鼠皮膚中Hrd1表達(dá)的影響（×400）紫外線組小鼠皮膚中Hrd1表達(dá)較對(duì)照組明顯升高，ATRA+紫外線組小鼠皮膚中Hrd1表達(dá)較紫外線組明顯下降（紅色箭頭處為成纖維細(xì)胞）

UVB照射時(shí)4組人皮膚成纖維細(xì)胞Hrd1蛋白水平分別為0.424±0.007、1.036±0.077、0.691±0.036、0.356±0.062，差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=102.119，P＜0.001），其中紫外線組高于對(duì)照組（t=12.524，P=0.006）和ATRA+紫外線組（t=9.920，P=0.01）。

四、紫外線及ATRA對(duì)人皮膚成纖維細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響（圖4）

圖3 Western印跡法檢測(cè)紫外線及全反式維A酸（ATRA）對(duì)人成纖維細(xì)胞中Hrd1表達(dá)的影響紫外線組Hrd1的蛋白水平均高于對(duì)照組，ATRA+紫外線組Hrd1蛋白水平均低于紫外線組

圖4 紫外線及全反式維A酸（ATRA）對(duì)細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）水平的影響4A：熒光顯微鏡觀察各組內(nèi)ROS生成情況；4B、4C：各組ROS水平統(tǒng)計(jì)結(jié)果。a：P＜0.01；b：P＜0.05

UVA照射時(shí)，對(duì)照組、紫外線組、紫外線+ATRA組、ATRA組間人皮膚成纖維細(xì)胞內(nèi)ROS水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=51.214，P＜0.001），紫外線組高于對(duì)照組（t=16.233，P=0.001）和ATRA+紫外線組ROS水平低于紫外線組（t=5.619，P=0.011）。UVB照射時(shí)，4組間ROS水平差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=44.735，P＜0.001），紫外線組高于對(duì)照組（t=11.925，P=0.001）和ATRA+紫外線組（t=14.557，P=0.001）。

討論

不論是UVA還是UVB都可以促進(jìn)皮膚成纖維細(xì)胞中ROS的產(chǎn)生，激活細(xì)胞內(nèi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激［15］。為了應(yīng)對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)會(huì)激活一系列信號(hào)通路，統(tǒng)稱(chēng)為未折疊蛋白反應(yīng)（unfolded protein response）［3］，包括暫停早期蛋白質(zhì)合成及誘導(dǎo)ERAD等。未折疊蛋白反應(yīng)由位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的3個(gè)傳感器IRE1、PERK和ATF6發(fā)出信號(hào)［16］。Hrd1又稱(chēng)作滑膜素（synoviolin），是未折疊蛋白反應(yīng)中IRE1的下游效應(yīng)器［8，17］。Xu等［9］研究發(fā)現(xiàn)，Hrd1通過(guò)特異性結(jié)合并降解IGF-1R抑制乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移。IGF-1R也是重要的促進(jìn)皮膚成纖維細(xì)胞膠原合成的分子［18］，還可增強(qiáng)紫外線照射后皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞的生存率［19］。Wu等［7］在研究肝硬化時(shí)發(fā)現(xiàn)Hrd1作為Nrf2的特異性E3泛素連接酶，通過(guò)降解Nrf2加重細(xì)胞的氧化損傷。Nrf2也是皮膚成纖維細(xì)胞中重要的抗氧化損傷蛋白［20］。目前已證實(shí)Hrd1的特異性結(jié)合底物Nrf2及IGF-1R均在抵抗皮膚光老化中發(fā)揮重要作用，而Hrd1本身在光老化中的作用還不明確。

我們?cè)谇捌谘芯恐型ㄟ^(guò)用紫外線照射人皮膚成纖維細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)紫外線可誘導(dǎo)Hrd1表達(dá)增高［10］。本次實(shí)驗(yàn)中，我們收集12例臨床標(biāo)本，發(fā)現(xiàn)在不同年齡段皮膚組織中，曝光部位Hrd1的表達(dá)水平明顯高于避光部位；同時(shí)，在慢性紫外線照射的小鼠皮膚中Hrd1的表達(dá)也明顯增高。進(jìn)一步證實(shí)紫外線照射可以顯著增加Hrd1的表達(dá)，也提示Hrd1可能參與光老化的發(fā)病機(jī)制。

ATRA是臨床治療光老化的經(jīng)典藥物［11］，其機(jī)制主要是抑制紫外線誘導(dǎo)的基質(zhì)金屬蛋白酶的產(chǎn)生以及促進(jìn)膠原合成［21-22］。我們發(fā)現(xiàn)，外用ATRA乳膏處理的小鼠皮膚在慢性紫外線照射后，皮膚Hrd1的表達(dá)較單純照光組降低。體外實(shí)驗(yàn)中，我們也觀察到ATRA處理可以使細(xì)胞Hrd1蛋白水平較單純照光組下降。這些結(jié)果均提示Hrd1可能是ATRA的治療靶點(diǎn)。我們還驗(yàn)證了ATRA處理可以抑制紫外線誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)ROS生成，結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致［23］。細(xì)胞內(nèi)ROS的大量產(chǎn)生是激活未折疊蛋白反應(yīng)的基礎(chǔ)，故而推測(cè)ATRA抑制紫外線誘導(dǎo)的Hrd1高表達(dá)可能與ATRA抑制細(xì)胞ROS生成有關(guān)。

綜上，本研究證實(shí)了紫外線照射不論在體外還是體內(nèi)都可以顯著提高皮膚成纖維細(xì)胞中Hrd1的表達(dá)，而ATRA可以抑制這一過(guò)程，其機(jī)制可能與ATRA抑制細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生有關(guān)。但Hrd1在光老化過(guò)程中發(fā)揮作用的具體機(jī)制還需要進(jìn)一步探索。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突