文龍 潘晶 王佩茹 張浩南 張國龍 王學鼎 程茜 王秀麗

1安徽醫(yī)科大學上海皮膚病臨床學院 上海市皮膚病醫(yī)院光醫(yī)學治療科，上海 200443；2同濟大學物理科學與工程學院聲學研究所，上海 200092；3上海市皮膚病醫(yī)院光醫(yī)學治療科 同濟大學醫(yī)學院光醫(yī)學研究所 200443；4Department of Biomedical Engineering，University of Michigan，Ann Arbor，MI 48109，USA

皮膚鱗狀細胞癌（簡稱鱗癌）是一種發(fā)生于上皮細胞的常見皮膚惡性腫瘤［1］，其確診依賴于組織病理檢查，但存在有創(chuàng)、耗時長、過程繁瑣等不足。生物醫(yī)學光聲技術(shù)（photoacoustic）是一種基于光聲效應的無創(chuàng)診斷技術(shù)［2］，近年已成為臨床醫(yī)學影像領(lǐng)域的研究熱點。光聲效應的原理為脈沖激光或連續(xù)調(diào)制激光被組織吸收后，引起組織周期性熱彈體積脹縮并以聲波形式傳輸出來，即光聲信號［3］。這些信號攜帶了組織的光學、彈性、熱力學和結(jié)構(gòu)等豐富的理化信息，通過處理分析后可用于疾病的診斷與組織的評估［4］。目前光聲技術(shù)在皮膚疾病中的研究較少，主要是基于對所獲光聲信號進行圖像重建，達到對皮膚組織進行組織結(jié)構(gòu)或功能成像［5-7］。在皮膚腫瘤研究方面，多數(shù)研究聚焦于黑素瘤的光聲成像研究［8-9］，但皮膚鱗癌的光聲研究僅有個別報道［10］。我們擬采用光聲成像及光聲譜技術(shù)研究兩種皮膚鱗癌小鼠模型，初步探索光聲技術(shù)在皮膚鱗癌無創(chuàng)診斷中的應用。

一、材料與儀器

6～8周齡健康雌性SPF級BALB/C裸鼠60只（上海杰思捷實驗動物有限公司，合格證號：18030521-4），動物實驗許可證［SCXK（滬）2018-0004］，體重約20 g，飼養(yǎng)于同濟大學醫(yī)學院SPF級實驗動物中心，予以標準滅菌飼料和潔凈水飼養(yǎng)。人皮膚鱗癌A431細胞株（上海中喬新舟生物有限公司）；小鼠皮膚鱗癌XL50細胞系（中國典型培養(yǎng)物保藏中心，編號：C201827）；小鼠胚胎成纖維細胞3T3細胞株（中國科學院上海細胞生物學研究所）。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶（美國Gibco公司），RPMI 1640培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液、青霉素/鏈霉素雙抗（美國Hyclone公司）。Acoustic X光聲成像系統(tǒng)（日本PreXion公司）。光聲譜檢測系統(tǒng)：脈沖激光器（美國OPOTEK公司），針式水聽器（美國Onda公司），放大器（日本Olympus公司），示波器（美國Teledyne LeCroy公司）。

二、建立XL50、A431裸鼠模型

取處于對數(shù)生長期的XL50細胞（與3T3細胞以5∶1比例混合）、A431細胞均按6×106個/只接種于裸鼠右側(cè)背部近上肢處，各接種30只，接種后按上述條件飼養(yǎng)。每日測量腫瘤直徑，選取腫瘤直徑為5～7 mm的小鼠各20只供實驗檢測，分別簡稱為X-SCC、A-SCC。

三、光聲成像及光聲譜檢測

光聲成像時，用850 nm LED光源，脈沖重復頻率為4 kHz，脈沖寬度為70 ns，光功率密度＜5.98×103W/m2。成像平均次數(shù)為640次。使用陣列超聲探頭進行成像檢測，探頭的中心頻率為9 MHz。將超聲耦合劑涂抹于瘤體及對側(cè)正常皮膚表面，成像探頭垂直于瘤體及正常皮膚進行腫瘤和正常皮膚成像。

使用光聲譜檢測系統(tǒng)對兩種皮膚鱗癌及左側(cè)背部正常皮膚進行光聲譜檢測。檢測時，對腫瘤及正常皮膚組織進行重復頻率為10 Hz、脈沖寬度5 ns的脈沖激光輻照，產(chǎn)生的光聲信號經(jīng)耦合劑耦合，由針式水聽器（帶寬1～20 MHz）接收；使用光闌控制使腫瘤與正常組織的激光輻照光斑尺寸相同，光斑直徑為8 mm。將獲得的兩種瘤體與正常組織的光聲數(shù)據(jù)進行能量歸一，使用MATLAB 2016軟件進行數(shù)據(jù)分析，再用pWelch函數(shù)對光聲數(shù)據(jù)進行時頻轉(zhuǎn)換，計算并繪制得到光聲功率譜，并在1.5～10 MHz聲頻范圍內(nèi)進行線性擬合，提取光聲功率譜的擬合斜率。

四、組織病理學檢查

光聲檢測完成后，頸椎脫臼法處死小鼠，使用6 mm環(huán)鉆鉆取腫瘤組織及對側(cè)正常皮膚，4%中性甲醛固定后行組織病理檢查。

五、統(tǒng)計學處理

六、結(jié)果

1.兩種皮膚鱗癌裸鼠模型光聲成像結(jié)果：850 nm波長下光聲成像顯示，兩種皮膚鱗癌裸鼠模型各20只瘤體均可見較強的血紅蛋白光聲信號，正常皮膚未見明顯光聲信號（圖1）。

2.兩種皮膚鱗癌裸鼠模型光聲譜的聲功率譜：光聲信號經(jīng)MATLAB 2016軟件分析及處理后，得到聲功率譜及擬合斜率（圖2）。X-SCC模型腫瘤組織聲功率譜擬合斜率（-1.827±0.153）低于正常皮膚組織（-1.059±0.118），差異有統(tǒng)計學意義（t=3.973，P＜0.001）；A-SCC模型腫瘤組織聲功率譜擬合斜率（-1.537±0.126）亦低于對側(cè)正常皮膚組織（-0.960±0.260），差異有統(tǒng)計學意義（t=2.166，P=0.043）。

圖1 小鼠鱗狀細胞癌裸鼠模型（X-SCC）及人皮膚鱗狀細胞癌裸鼠模型（A-SCC）正常皮膚與腫瘤瘤體光聲成像圖光聲信號強度在光聲成像中以紅藍偽彩表示，兩種瘤體（黃色虛線圓圈所示）可見較強的血紅蛋白光聲信號（偽彩顏色越紅表示光聲信號越強），而正常皮膚（紅色虛線圓圈所示）未見明顯光聲信號

圖2 小鼠鱗狀細胞癌裸鼠模型（X-SCC）及人皮膚鱗狀細胞癌裸鼠模型（A-SCC）正常皮膚與腫瘤瘤體的光聲聲功率譜曲線及擬合斜率2A：X-SCC；2B：A-SCC

3.兩種皮膚鱗癌裸鼠模型組織病理結(jié)果：20只X-SCC小鼠腫瘤組織病理均可見腫瘤細胞致密排列，血管散在分布，相比正常皮膚組織血管增多并出現(xiàn)壞死出血；20只A-SCC小鼠腫瘤組織病理均顯示腫瘤細胞呈團塊樣，相比正常皮膚組織血管增多。見圖3。

七、討論

近年來，皮膚鏡、光學相干斷層成像（OCT）、皮膚共聚焦顯微鏡等在皮膚腫瘤無創(chuàng)診斷領(lǐng)域取得一定進展［11-14］，但以上技術(shù)均以光學成像為基礎，光在生物組織中具有強散射性，故穿透深度有限。以聲成像為基礎的技術(shù)如高頻超聲，可以提供較深的成像深度［15］，然而其信號反差源于生物組織的聲阻抗差異，因此難以區(qū)分化學性質(zhì)有所差異但物理性質(zhì)相差不大的腫瘤組織與正常組織。

圖3 小鼠皮膚鱗狀細胞癌裸鼠模型（X-SCC）及人皮膚鱗狀細胞癌裸鼠模型（A-SCC）正常皮膚與腫瘤組織病理（圖中標尺=100 μm）X-SCC腫瘤組織中腫瘤細胞致密排列，血管增多并出現(xiàn)壞死出血；A-SCC腫瘤組織中腫瘤細胞呈團塊樣，血管增多

光聲技術(shù)利用光聲效應形成光聲信號，這些信號攜帶了組織的光學、彈性、熱力學和結(jié)構(gòu)等豐富的理化信息。我們前期研究中，已將自行搭建的光聲成像系統(tǒng)用于膽管癌的成像，成功獲得膽管癌的光聲圖像［16］，還驗證了光聲功率譜用于前列腺癌診斷的可行性，獲得前列腺癌的光聲譜特征［17］。本研究中，我們將光聲檢測用于X-SCC及A-SCC裸鼠模型的在體檢測。腫瘤的發(fā)生發(fā)展需要大量的營養(yǎng)物質(zhì)供應，故往往伴隨腫瘤新生血管的生長［18］，組織內(nèi)血紅蛋白含量可以間接反映腫瘤相關(guān)新生血管的生長。因此，我們檢測850 nm波長（血紅蛋白特征吸收波長）處光聲信號，光聲成像顯示兩種皮膚鱗癌裸鼠模型的瘤體內(nèi)可見強的光聲信號，說明腫瘤中含豐富的血紅蛋白，這與病理顯示鱗癌瘤體內(nèi)血管、血液增多相符。既往研究報道，基于血紅蛋白特征波長的光聲成像能夠?qū)崿F(xiàn)對腎癌種植瘤內(nèi)新生血管的檢測［19］，因此，結(jié)合本研究的結(jié)果可以推測光聲可以對皮膚鱗癌進行血液成分的成像從而反映腫瘤中增多的血管。

光聲譜檢測結(jié)果顯示，該系統(tǒng)成功地獲得了兩種皮膚鱗癌與正常皮膚組織的光聲信號，信號較穩(wěn)定。同時，對所獲的光聲數(shù)據(jù)進行能量歸一計算擬合斜率，顯示兩種皮膚鱗癌模型腫瘤組織聲功率譜擬合斜率均為負值，且均低于正常皮膚組織。光聲功率譜的擬合斜率的絕對值反映了組織中高頻信號的相對量，高頻信號越多代表組織結(jié)構(gòu)越不均勻或異質(zhì)性越大。Huang等［17］對不同分期的前列腺癌組織的研究表明相較于早期前列腺癌而言，晚期前列腺癌組織的擬合斜率絕對值明顯升高，對應病理也顯示晚期前列腺癌的異質(zhì)性增高。本研究結(jié)果顯示皮膚鱗癌組織的擬合斜率絕對值相較于正常皮膚組織明顯升高，而組織病理結(jié)果也顯示鱗癌中腫瘤細胞排列緊密，結(jié)構(gòu)異質(zhì)性高，與斜率的統(tǒng)計分析結(jié)果一致。因此，光聲功率譜擬合斜率可以反映皮膚鱗癌的組織結(jié)構(gòu)變化。

綜上所述，我們成功獲得皮膚鱗癌的光聲成像和光聲譜數(shù)據(jù)，同時通過檢測兩種皮膚鱗癌裸鼠模型腫瘤組織與正常皮膚850 nm波長處光聲信號，發(fā)現(xiàn)兩種鱗癌裸鼠模型光聲信號的聲功率譜的斜率均顯著低于正常組織。本研究中僅選取血紅蛋白特征吸收波長，獲得的腫瘤光聲數(shù)據(jù)較單一，今后我們將研究更多組分如膠原、色素、脂質(zhì)等物質(zhì)的特征波長下的光聲數(shù)據(jù)，期望得到皮膚鱗癌以及更多的皮膚腫瘤的光聲數(shù)據(jù)，并在光譜及聲譜兩個維度展開研究，以期能初步對皮膚腫瘤進行光聲的無創(chuàng)診斷。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突