曾菁莘 田歆 朱慧蘭 張錫寶 林玲 張麗丹 劉煒鈺 羅權(quán)

1廣州醫(yī)科大學(xué)皮膚病研究所 廣州市皮膚病防治所皮膚科 510095；2廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院皮膚科 510150

銀屑病是一種多基因遺傳背景下由T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的慢性炎癥性增生性疾病［1］。T細(xì)胞亞群的免疫失衡在銀屑病發(fā)病中起重要作用［2］。微小RNA（microRNA，miRNA）是一類高度保守的非編碼小分子單鏈RNA，在調(diào)節(jié)角質(zhì)形成細(xì)胞增殖分化、皮膚炎癥及免疫細(xì)胞之間的相互影響等方面發(fā)揮重要作用［3］。miRNA-148a-3p是一種缺氧誘導(dǎo)的miRNA［4］，缺氧是多種病理?xiàng)l件如炎癥、組織缺血及實(shí)體瘤等的共同特征［5］。研究表明，miRNA-148a-3p在T細(xì)胞及B細(xì)胞介導(dǎo)的慢性炎癥性疾病、自身免疫性疾病及癌癥的發(fā)生發(fā)展中起重要的調(diào)控作用［6-7］，但其在尋常型銀屑病中的表達(dá)及其對CD4+T淋巴細(xì)胞的調(diào)控作用及機(jī)制尚不清楚。我們通過分析miRNA-148a及其潛在靶基因B淋巴細(xì)胞瘤2相互作用的細(xì)胞死亡調(diào)節(jié)因子（bcl-2 interacting mediator of cell death，Bim）在尋常型銀屑病患者外周血中的表達(dá)，探討miRNA-148a-3p可能的調(diào)控作用。

對象與方法

一、對象

收集2017年7月至2018年4月就診于廣州市皮膚病防治所的20例尋常型銀屑病患者。男11例，女9例，年齡18～62（41.55±13.74）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：結(jié)合臨床表現(xiàn)及皮損組織病理確診為尋常型銀屑病的患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：近3周外用糖皮質(zhì)激素及免疫抑制劑；近1個(gè)月系統(tǒng)應(yīng)用糖皮質(zhì)激素、阿維A、免疫抑制劑等，有紫外線治療及日光浴史；有心臟、肝、腎疾病及精神疾病者；處于感染、妊娠、分娩、外傷等應(yīng)激狀態(tài)；有惡性腫瘤者。病情嚴(yán)重程度采用銀屑病面積及嚴(yán)重程度評分法（PASI）評估。健康對照組20例，為本院工作人員，均無系統(tǒng)性疾病及自身免疫性疾病家族史，其中男13例，女7例，年齡22～42（29.32±9.45）歲。本研究經(jīng)廣州市皮膚病防治所醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批件號201717），受試者均簽署知情同意書。

二、主要試劑及儀器

EasySep?直接人CD4+T細(xì)胞分選（負(fù)選）試劑盒（加拿大Stemcell公司），總RNA抽提試劑Trizol（美國Invitrogen公司），牛血清白蛋白（BSA）（美國Sigma公司），DMEM培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液（PBS）、胰酶（美國Gibco公司），雙熒光素酶報(bào)告檢測試劑盒（美國Promega公司），miRNA熒光定量PCR試劑盒（廣州銳博生物科技有限公司），兔抗人Bim單克隆抗體、山羊抗兔二抗（英國Abcam公司），DynaMag?磁體（美國Thermo公司）。

三、方法

1.CD4+T淋巴細(xì)胞分選：抽取受試者外周靜脈血10 ml。采用EasySep?直接人CD4+T細(xì)胞分選（負(fù)選）試劑盒分選CD4+T淋巴細(xì)胞，使用抗體復(fù)合物和磁珠標(biāo)記紅細(xì)胞、血小板和不需要的細(xì)胞，用EasySep?磁極將磁珠標(biāo)記的非目的細(xì)胞與未經(jīng)標(biāo)記的CD4+T細(xì)胞分離，將目的細(xì)胞轉(zhuǎn)入新試管中，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞純度，臺盼藍(lán)法計(jì)數(shù)，每管約3×106個(gè)分裝，離心后吸干上清液，將細(xì)胞沉淀于-80℃凍存。

2.實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）檢測CD4+T細(xì)胞中miRNA-148a的表達(dá)：用Trizol試劑提取受試者外周血CD4+T細(xì)胞總RNA，采用紫外可見光分光光度計(jì)測定RNA濃度，以A260/A280比值判定純度。通過逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄獲得miRNA-148a-3p的cDNA，以U6作為內(nèi)參，熒光定量PCR檢測miRNA-148a-3p的表達(dá)，引物（編號ssD089261711、ssD809230166、ssD809230858、ssD0904071006、ssD0904071007、ssD0904071008）由廣州銳博生物科技有限公司設(shè)計(jì)并合成，反應(yīng)體系的配制及反應(yīng)條件的設(shè)置均按照熒光定量PCR試劑盒說明書進(jìn)行，采用2-ΔΔCt計(jì)算miRNA-148a-3p相對表達(dá)量。

3.miRNA-148a-3p靶基因的預(yù)測與驗(yàn)證：通過Mirbase/Targetscans/PicTar等生物信息學(xué)軟件篩選出一系列與尋常型銀屑病發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)的9條靶基因WNT1、IGF1、BCL2L13、BCL2L11、EGFR、DNMT1、EGR3、HMGB3、MITF，其中BCL2L11基因編碼的Bim已被證實(shí)參與自身免疫調(diào)控，因此選擇Bim基因開展靶基因驗(yàn)證。

（1）雙熒光素酶載體的構(gòu)建：根據(jù)人BCL2L11-3′UTR序列信息設(shè)計(jì)其擴(kuò)增引物，即h-BCL2L11-3UTR-F（3298）（XhoI）：5′-GGCGCTCGAGCAACTC AGCGTTTAGAAAAGAAATA-3′；h-BCL2L11-3UTR- R （4127） （NotI） ： 5′ -AATGCGGCCGCAGTGGCAATT ACCCTGTCAAA-3′，其中下劃線標(biāo)出的序列為XhoI、NotI兩個(gè)酶切位點(diǎn)。將含有miRNA-148a-3p結(jié)合位點(diǎn)的BCL2L11 3′UTR序列的片段克隆到pMIR-REPORT?雙螢光素酶報(bào)告載體中，獲得野生型h-BCL2L11-3UTR報(bào)告基因載體；在構(gòu)建好的野生型報(bào)告基因載體基礎(chǔ)上，利用點(diǎn)突變PCR將miRNA-148a-3p的結(jié)合位點(diǎn)突變?yōu)榛パa(bǔ)序列，獲得突變型h-BCL2L11-3UTR報(bào)告基因載體。

（2）雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測：將293T細(xì)胞分成兩組，分別轉(zhuǎn)染含野生型（WT）和突變型（MUT）BCL2L11 3′UTR的質(zhì)粒，再將上述兩組細(xì)胞分成兩個(gè)亞組，分別轉(zhuǎn)染miRNA-148a-3p模擬物（miRNA-148a-3p亞組）和陰性對照模擬物（陰性對照亞組），報(bào)告基因與模擬物共轉(zhuǎn)染48 h后，利用雙熒光素酶報(bào)告檢測試劑盒進(jìn)行雙熒光素酶檢測，以熒光照度計(jì)測定熒光值。

4.Westen印跡法檢測CD4+T細(xì)胞中Bim蛋白水平：檢測11例銀屑病患者及8例健康對照CD4+T細(xì)胞中Bim蛋白的水平。通過蛋白裂解液在冰上充分裂解CD4+T細(xì)胞60 min，BCA法測蛋白濃度。制備十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠，常規(guī)電泳后將凝膠轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。取出轉(zhuǎn)移膜，用3%BSA封閉。結(jié)束后將膜用TBST緩沖液漂洗1次，然后加入含3%BSA的抗Bim抗體（稀釋2 000倍），放入4℃冰箱孵育過夜。次日，回收一抗，放入-20℃冰箱。將膜用TBST漂洗3次，然后加入含3%BSA的山羊抗兔IgG二抗（稀釋3 000倍），在搖床上室溫孵育1 h后，用TBST緩沖液漂洗3次，加入ECL發(fā)光劑處理并發(fā)光顯像、拍照，根據(jù)目的條帶的灰度值分析蛋白表達(dá)水平。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié)果

一、CD4+T細(xì)胞中miRNA-148a-3p表達(dá)水平

由受試者外周血樣本提取的RNA濃度為3.49～57.42 mg/L，去除濃度低于20 mg/L的樣品后，剩余18份患者及12份對照標(biāo)本。18例尋常型銀屑病患者中，男10例，女8例，年齡23～58（37.45±9.46）歲；健康對照組12例中，男7例，女5例，年齡24～42（32.33±6.10）歲。兩組患者年齡（t=1.65，P＞0.05）和性別分布（χ2=0.02，P＞0.05）差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。尋常型銀屑病組miRNA-148a-3p相對表達(dá)水平（2-ΔΔCt）為5.61±1.66，健康對照組為1.00±0.26，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（U=12，P＜0.05）。

二、miRNA-148a-3p表達(dá)量與PASI評分的相關(guān)性分析

18例尋常型銀屑病患者PASI評分為2.5～20.6（7.77±4.47）分，Spearman相 關(guān)分 析 顯示，miRNA-148a-3p表達(dá)量與PASI評分呈正相關(guān)，r=0.93，P＜0.001。見圖1。

三、miRNA-148a-3p靶基因驗(yàn)證

成功構(gòu)建報(bào)告基因載體后，雙熒光素酶報(bào)告檢測結(jié)果示（圖2）：與陰性對照亞組相比，WT-Bim 3′UTR組中miRNA-148a-3p亞組熒光素螢光素酶活性明顯下調(diào)（t=6.52，P＜0.05），而MUT-Bim 3′UTR組中miRNA-148a-3p亞組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.73，P＞0.05）。

四、CD4+T細(xì)胞中Bim蛋白的水平

尋常型銀屑病患者組CD4+T細(xì)胞中Bim蛋白的表達(dá)水平為0.69±0.07，健康對照組為0.93±0.06，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.38，P＜0.01）。見圖3。

五、尋常型銀屑病患者CD4+T細(xì)胞中Bim水平與PASI評分的相關(guān)性

11例尋常型銀屑病患者PASI評分為2.8～10.5（6.82±2.12）分，與外周血CD4+T細(xì)胞中Bim表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)（r=-0.774，P＜0.01）。見圖4。

討論

圖1 18例尋常型銀屑病患者外周血CD4+T細(xì)胞miRNA-148a-3p表達(dá)量與銀屑病皮損面積和嚴(yán)重程度指數(shù)（PASI）呈正相關(guān)

圖2 雙熒光素酶報(bào)告驗(yàn)證miRNA-148a-3p可靶向作用Bim3′UTR Luc/Rluc比值：代表熒光素酶活性。a：兩組間比較，P＜0.05。1：轉(zhuǎn)染野生型BCL2L11 3′UTR質(zhì)粒和陰性對照模擬物組；2：轉(zhuǎn)染野生型BCL2L11 3′UTR質(zhì)粒和miRNA-148a-3p模擬物組；3：轉(zhuǎn)染突變型BCL2L11 3′UTR質(zhì)粒和陰性對照模擬物組；4：轉(zhuǎn)染野生型BCL2L11 3′UTR質(zhì)粒和miRNA-148a-3p模擬物組

銀屑病皮損表皮和真皮內(nèi)有大量T細(xì)胞浸潤，CD4+T細(xì)胞在皮膚歸巢前就已活化，活化后的CD4+T細(xì)胞主要向Th1、Th17和Th22淋巴細(xì)胞分化，釋放促炎癥細(xì)胞因子進(jìn)一步招募異?；罨馨图?xì)胞，刺激角質(zhì)形成細(xì)胞增殖從而誘導(dǎo)銀屑病發(fā)生發(fā)展［8］。miRNA是細(xì)胞生長、增殖分化、凋亡及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)物質(zhì)，近年來研究發(fā)現(xiàn)多種miRNA在銀屑病皮損中表達(dá)改變，如miRNA-30e-5p、miRNA-192-5p、miRNA-17-3p在皮損中表達(dá)下調(diào)，而miRNA-320c、miRNA-let-7a-5p、miRNA-125b-5p、miRNA-642a-5p、miRNA-29a-5p表達(dá)則明顯上調(diào)［9］，部分miRNA被證實(shí)可通過作用于特定靶基因參與調(diào)控銀屑病皮損組織的炎癥反應(yīng)。Liu等［10］研究表明，miRNA-148a-3p可靶向作用于蛋白激酶CaMKIIα從而削弱樹突細(xì)胞的抗原提呈及固有免疫，蛋白激酶CaMKIIα還可降低MHC-Ⅱ類分子的表達(dá)。然而，miRNA參與調(diào)控尋常型銀屑病免疫細(xì)胞異?；罨瘷C(jī)制的研究目前仍較少見。Wu等［11］研究表明，過表達(dá)的miRNA-210通過調(diào)控靶基因STAT6和LYN促進(jìn)Th17和Th1細(xì)胞分化，抑制Th2細(xì)胞分化，從而促進(jìn)銀屑病皮損形成。本研究顯示，尋常型銀屑病患者外周血CD4+T淋巴細(xì)胞miRNA-148a-3p表達(dá)高于健康對照組，且其與尋常型銀屑病病情相關(guān)，提示miRNA-148a-3p的異常表達(dá)可能在尋常型銀屑病患者T細(xì)胞中發(fā)揮重要作用。

此外，微環(huán)境中如缺氧和細(xì)胞因子等改變也會(huì)影響miRNA-148a-3p的表達(dá)。Hsiao等［12］研究發(fā)現(xiàn)，在子宮內(nèi)膜異位癥中低氧可通過AUF1/miRNA-148a-3p通路使DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶1（DNMT1）失調(diào)從而引起整體低甲基化。Porstner等［13］研究發(fā)現(xiàn)，活化的B細(xì)胞可上調(diào)miRNA-148a-3p的表達(dá)，miRNA-148a-3p上調(diào)后又可促進(jìn)活化的B細(xì)胞分化成漿細(xì)胞，并且通過抑制轉(zhuǎn)錄因子BTB-CNC異體同源體2（BTB and CNC homolog 2，Bach2）、小眼畸形 轉(zhuǎn) 錄 因 子（microphthalmia transcription factor，MITF）及張力蛋白同源物（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN）來增強(qiáng)漿細(xì)胞的存活率。以上研究提示，miRNA-148a在調(diào)控細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用。我們通過多個(gè)生物信息學(xué)軟件及權(quán)威數(shù)據(jù)庫分析出促凋亡蛋白Bim為miRNA-148a-3p的潛在靶基因之一，隨后構(gòu)建熒光素酶報(bào)告載體證實(shí)miRNA-148a-3p對Bim基因的表達(dá)具有直接調(diào)控作用。Bim是miRNA-148a-3p靶基因之一，作為一種重要的凋亡調(diào)節(jié)蛋白，在自身免疫性疾病及腫瘤的發(fā)生發(fā)展中有重要作用［14］。Kim等［15］研究表明，上調(diào)miRNA-148a-3p可沉默有絲分裂誘導(dǎo)基因6（mitogen-induced gene 6，MIG6）和Bim的表達(dá)從而抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡。我們發(fā)現(xiàn)，Bim在尋常型銀屑病組外周血的表達(dá)低于健康對照組，且與銀屑病嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)，這進(jìn)一步說明miRNA-148a-3p可能通過靶向作用促凋亡蛋白Bim參與尋常型銀屑病外周血CD4+T細(xì)胞的分化及凋亡機(jī)制，故有必要針對miRNA-148a-3p及其調(diào)節(jié)的T細(xì)胞亞群進(jìn)行深入研究，揭示其在尋常型銀屑病中的作用機(jī)制。

圖3 Western印跡檢測銀屑病患者（條帶1、5、6、7）及健康對照（條帶2、3、4、8）外周血CD4+T細(xì)胞中Bim蛋白的表達(dá)水平

圖4 11例尋常型銀屑病患者外周血CD4+T細(xì)胞Bim表達(dá)量與銀屑病皮損面積和嚴(yán)重程度指數(shù)（PASI）呈負(fù)相關(guān)

綜上所述，miRNA-148a-3p在尋常型銀屑病外周血CD4+T細(xì)胞中過表達(dá)，且可靶向調(diào)節(jié)促凋亡蛋白Bim的表達(dá)，在尋常型銀屑病的發(fā)生過程中具有重要的作用，而Bim蛋白表達(dá)下調(diào)可能打破T細(xì)胞亞群的平衡從而促進(jìn)銀屑病的發(fā)生發(fā)展。以miRNA-148a-3p為靶點(diǎn)進(jìn)行研究，有望為尋常型銀屑病的免疫學(xué)機(jī)制及治療的研究提供新的思路。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突