劉 紅，李華云，龔 冶，孫 琴，4*，代 勇**

(1西南醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院；2西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院藥學(xué)部；3四川警察學(xué)院刑事科學(xué)技術(shù)系；4西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合藥物研究中心，瀘州 646000)

“搖頭丸”(3，4-亞甲二氧基甲基苯丙胺為主要成分)和“K粉”(氯胺酮)是吸毒人員經(jīng)常混合吸食的毒品，目前對(duì)混合毒品檢測(cè)的報(bào)道主要集中在對(duì)原料藥和繳獲毒品的分析測(cè)定方面[1]，對(duì)生物檢材中毒品的檢測(cè)大多針對(duì)單一毒品及其代謝物，其前處理通常采用液相萃取或固相萃取等方式[2]。近年來(lái)，固相微萃取作為一種快速便捷的提取方式，已廣泛用于生物樣品的前處理。在公安機(jī)關(guān)打擊毒品犯罪的實(shí)際工作中，尿液因其易于采集、無(wú)損害且能反映毒品在體內(nèi)代謝情況，已作為一種重要的生物物證，成為公安機(jī)關(guān)判斷吸毒嫌疑人是否吸食毒品的首選檢材[3]。目前，對(duì)混合毒品的檢測(cè)大多采用氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)實(shí)驗(yàn)條件有一定的要求。本研究采用固相微萃取-液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，為此類混合毒品及其代謝產(chǎn)物的檢測(cè)提供新的檢測(cè)方法。

本研究以尿液中的氯胺酮與3，4-亞甲二氧基甲基苯丙胺(MDMA)及其主要代謝物去甲氯胺酮、3，4-亞甲二氧基苯丙胺(MDA)為檢測(cè)對(duì)象，以固相微萃取作為樣品前處理手段，并考察了其萃取條件，確定了HPLC-MS對(duì)尿液中氯胺酮、去甲氯胺酮、MDMA和MDA的檢測(cè)方法，希望為公安機(jī)關(guān)提供較為便捷、準(zhǔn)確的生物檢材中混合毒品的鑒別方法，同時(shí)也為其他混合毒品及其體內(nèi)代謝物的分析與檢測(cè)提供參考與借鑒。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器及測(cè)試條件

儀器：Agilent-1200 Series液相色譜儀，配G6130A質(zhì)譜儀(美國(guó)Agilent公司)；色譜柱為鍵合EC-C18柱(4.6 mm×100 mm，2.7 μm；美國(guó)Agilent公司)。萃取頭：85 μm聚丙烯(PA)、100 μm聚二甲基硅氧烷(PDMS)、60 μm聚二甲基硅烷-二乙烯基苯共聚物萃取頭(PDMS/DVB)、SPME進(jìn)樣器、CORNING固相微萃取采樣臺(tái)(美國(guó)Supelco公司)；GPA224S萬(wàn)分之一分析天平(德國(guó)Sartorius公司)；KH3200E型超聲清洗儀(上海聲源超聲波儀器設(shè)備有限公司)。

色譜條件：采用EC-C18柱(4.6 mm×100 mm，2.7 μm)色譜柱，以0.1%甲酸水(A)-甲醇(B)作為流動(dòng)相，梯度洗脫：0～6 min，70%A→30%A，6～7 min，30%A→10%A，保持3 min。流速0.2 mL/min，進(jìn)樣量1 μL，柱溫40 ℃。

質(zhì)譜條件：采用電噴霧電離源正離子掃描(ESI+)，SIM監(jiān)測(cè)模式；干燥氣(N2)流速：10 L/min，干燥器溫度：350 ℃，霧化電壓3 kV，數(shù)據(jù)采集0～10 min，待檢測(cè)物的SIM監(jiān)測(cè)離子和碰撞能見(jiàn)表1。

Table1 SIM of analyte monitor ions and collision energy

DrugParent ions/(m/z)Product ions/(m/z)Collision energy/eVKetamine238.1179*18Norketamine224.1207*15MDMA194.1163*15MDA180.1163.1*11

*Quota ion

MDMA:3,4-Methylenedioxymethamphetamine;MDA:3,4-Methylenedioxyamphetamine

1.2 藥品與試劑

對(duì)照品氯胺酮、去甲氯胺酮、MDMA、MDA(均為甲醇液，質(zhì)量濃度為1.00 mg/mL)均由瀘州市公安局提供。甲醇、乙腈均為色譜純，鹽酸、碳酸鈉和氫氧化鈉等其余試劑均為分析純，水為純化水。

對(duì)照儲(chǔ)備溶液的制備：分別取氯胺酮、去甲氯胺酮、MDMA、MDA標(biāo)準(zhǔn)品甲醇液1 mL，稀釋為100 mL，置于4 ℃冰箱保存。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)別大鼠，重量(200±10)g，雌雄各半，西南醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供(使用許可證號(hào)：SCXK(川)2018-17)。給藥前禁食不禁水12 h，灌胃給藥。

1.4 尿液樣品的制備

取健康人空白尿液10 mL，分別添加氯胺酮、去甲氯胺酮、MDMA和MDA對(duì)照儲(chǔ)備液，配制成氯胺酮、去甲氯胺酮、MDMA、MDA均為1 μg/mL的毒品尿液樣品，備用。

1.5 操作方法

取尿液樣品5 mL于10 mL樣品瓶中，用1.25 mol/mL HCl和NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至11，加入Na2CO30.5 g，放入磁攪拌子，擰緊瓶蓋，將樣品瓶置于SPME專用采樣臺(tái)上于60 ℃下加熱攪拌，同時(shí)將經(jīng)老化過(guò)的含60 μm聚二甲基硅烷-二乙烯基苯共聚物萃取頭(PDMS/DVB)的SPME針管插入樣品瓶中，推出萃取纖維頭，使之浸入樣品液中萃取15 min后取出，再將SPME針管插入SPME/HPLC接口解吸池中解析1 min后，進(jìn)行數(shù)據(jù)采集。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜柱及流動(dòng)相的考察

預(yù)實(shí)驗(yàn)中比較了C18柱(2.1 mm×50 mm，1.8 μm)和C18柱(4.6 mm×100 mm，2.7 μm)的檢測(cè)效果，發(fā)現(xiàn)因所檢測(cè)的氯胺酮和MDMA等物質(zhì)含有胺基和羰基等基團(tuán)，為中等偏強(qiáng)極性物質(zhì)，所以其保留時(shí)間較短，均在0.6 min左右出峰，為了提高分離效果，最終選擇了EC-C18柱(4.6 mm×100 mm，2.7 μm)作為分析柱。

氯胺酮、去甲氯胺酮、MDMA和MDA的保留時(shí)間、分離度和峰行受流動(dòng)相體系及其PH的影響。本實(shí)驗(yàn)分別考察了甲醇/乙腈-水、甲醇/乙腈-甲酸水溶液、甲酸乙腈-水溶液和甲酸乙腈-甲酸溶液體系等作為流動(dòng)相。結(jié)果表明，在酸性條件下，有助于化合物母離子的形成。比較甲酸體積分?jǐn)?shù)為0.1%、0.2%、0.3%時(shí)，發(fā)現(xiàn)增大甲酸濃度對(duì)化合物檢測(cè)靈敏度影響不大，因此，最終選擇甲醇和0.1%甲酸水溶液體系作為流動(dòng)相。

按以上色譜柱與流動(dòng)相對(duì)混合毒品進(jìn)行檢測(cè)，氯胺酮、去甲氯胺酮、MDMA和MDA的保留時(shí)間分別為6.52、6.60、4.99、5.03 min，見(jiàn)圖1。

Figure1 SIM chromatogram of ketamine,norketamine,MDMA,and MDA
A:Ketamine,m/z238.1;B:Ketamine,m/z179;C:Norketamine,m/z224.1;D:Norketamine,m/z207;E:MDMA,m/z194.1;F:MDMA,m/z163;G:MDA,m/z180.1;H:MDA,m/z163.1

2.2 固相微萃取前處理影響因素考察

2.2.1 萃取纖維種類和萃取模式考察 在實(shí)驗(yàn)中主要選擇了3種不同極性且適合于HPLC進(jìn)樣分析的萃取頭進(jìn)行考察：85 μm聚丙烯(PA) 、100 μm聚二甲基硅氧烷(PDMS)、60 μm聚二甲基硅烷-二乙烯基苯共聚物萃取頭(PDMS/DVB)，在相同的萃取條件下進(jìn)行直接浸入式(DI-SPME)萃取，以峰面積大小作為萃取效果的評(píng)價(jià)指標(biāo)，結(jié)果表明，由于PA萃取頭對(duì)強(qiáng)極性的物質(zhì)富集效果更好，PDMS萃取頭對(duì)弱極性物質(zhì)的萃取效果更好，故這兩種萃取頭的萃取效率略低。比較而言，PDMS/DVB共聚物極性介于前兩者之間，且適合于對(duì)胺類化合物的提取，故其萃取效率較前兩者高。

固相微萃取分為直接浸入模式(DI-SPME)和頂空模式(HS-SPME)兩種方式，由于本次檢測(cè)目的是以HPLC為檢測(cè)手段對(duì)兩種毒品在體內(nèi)的微量原型物和代謝物樣品進(jìn)行分析，故選用直接浸入模式，提高萃取效率。

2.2.2 萃取溶液酸堿度考察 本次檢測(cè)的4種物質(zhì)均為弱堿性，因此在堿性條件下，有利于減少其在基質(zhì)中的電離度和溶解度，促進(jìn)其從基質(zhì)中解析出，提高萃取率。為此，本研究考察了pH為9，10，11，12，13的不同條件下，對(duì)萃取效果的影響。隨著pH的增加，各物質(zhì)的萃取率均存在不同程度的上升，在pH為11以后時(shí)，4種物質(zhì)的萃取率基本保持恒定，且尿液基質(zhì)中開(kāi)始出現(xiàn)少許沉淀(可能在較強(qiáng)堿性條件下，其中的蛋白質(zhì)成分變性所致)，故選擇萃取酸堿度為pH 11。

2.2.3 萃取溫度和時(shí)間考察 查閱相關(guān)文獻(xiàn)[4]，發(fā)現(xiàn)溫度對(duì)萃取效果有較大的影響，其機(jī)制是通過(guò)改變目標(biāo)成分在溶液與萃取介質(zhì)間的分配系數(shù)，從而影響萃取纖維對(duì)目標(biāo)成分的吸附效率。隨著溫度升高，溶液中目標(biāo)成分的熱運(yùn)動(dòng)增加，目標(biāo)成分的分子向萃取纖維擴(kuò)散的概率大大提高，從而達(dá)到富集目標(biāo)成分的目的。但是，當(dāng)溫度過(guò)高時(shí)，將導(dǎo)致萃取纖維中的目標(biāo)成分向溶液中擴(kuò)散，破壞了分配平衡，這種反相擴(kuò)散有可能導(dǎo)致萃取的效率銳減。因此，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，須篩選適宜的溫度，才能取得較好的萃取效果。

在30～70 ℃區(qū)間范圍內(nèi)，以10 ℃遞增進(jìn)行萃取溫度條件考察，其結(jié)果如圖2所示，4種目標(biāo)物質(zhì)的萃取效率隨著溫度改變呈現(xiàn)先上升后下降的現(xiàn)象，因各物質(zhì)結(jié)構(gòu)間存在差異，其最佳萃取溫度并不一致，綜合考慮具體情況，選擇萃取溫度為60 ℃，同時(shí)，在萃取時(shí)加入攪拌子以增加待測(cè)物質(zhì)在基質(zhì)溶液中的熱運(yùn)動(dòng)，改善萃取平衡系數(shù)。

目標(biāo)物質(zhì)在基質(zhì)溶液與萃取介質(zhì)間的平衡時(shí)間受其物理化學(xué)性質(zhì)(如化學(xué)結(jié)構(gòu)、在兩相間的分配系數(shù)等)、基質(zhì)條件和萃取介質(zhì)吸附特性等多種因素決定，萃取時(shí)間短，介質(zhì)吸附不充分，未達(dá)到分配平衡，目標(biāo)物回收率較低，萃取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)費(fèi)時(shí)，達(dá)不到優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件的目的。

在5～25 min區(qū)間內(nèi)，以每5分鐘為一檢測(cè)點(diǎn)，峰面積為檢測(cè)指標(biāo)，選擇合適的萃取時(shí)間，其結(jié)果如圖3所示。由于4種目標(biāo)物質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量較小，在基質(zhì)與萃取介質(zhì)間的能較快地達(dá)到平衡，故選擇萃取時(shí)間為15 min。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性范圍及檢測(cè)限 取空白尿液檢材5份，添加氯胺酮、去甲氯胺酮、MDMA、MDA對(duì)照品，用流動(dòng)相稀釋，配制成0.03、0.20、0.50、0.75和1.0 μg/mL系列質(zhì)量濃度對(duì)照品的尿液樣本，按以上所述實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行目標(biāo)物提取與檢測(cè)分析，以待測(cè)物定量離子峰面積Y為縱坐標(biāo)，以所配制的系列對(duì)照品濃度X為橫坐標(biāo)，匯制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到4種待測(cè)物的線性方程、其各自的相關(guān)系數(shù)r和最低檢出限(檢測(cè)時(shí)信噪比為S/N=3)見(jiàn)表2。結(jié)果表明，4種待測(cè)物在0.03～1.0 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

Table2 Linear equations,correlation coefficient and detection limit (S/N,n=3)

AnalyteLinear regression equationrDetection limit/(ng/mL)KetamineY=5.527×104X-4.150×10-10.999 211.2NorketamineY=7.769×104X-8.998×10-10.999 110.8MDMAY=3.000×105X-6.103×10-20.998 913.6MDAY=3.850×105X-1.266×10-20.998 514.3

2.3.2 加樣回收試驗(yàn)及精密度考察 取空白尿液，分別加入高、中、低3個(gè)濃度的對(duì)照品，配制成5個(gè)平行樣品，按照“1.1”、“1.5”項(xiàng)下進(jìn)行檢測(cè)分析，連續(xù)測(cè)定3 d，并記錄色譜峰面積，計(jì)算氯胺酮、去甲氯胺酮、MDMA、MDA的日內(nèi)、日間精密度，結(jié)果如下表3所示。

在4種待測(cè)物線性方程范圍內(nèi)，取高、中、低3個(gè)濃度分別添加對(duì)照品，配制成5個(gè)平行樣本檢材，然后按“1.1”、“1.5”項(xiàng)下進(jìn)行樣品處理、分析。以所添加待測(cè)物的峰面積與相同濃度標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積之比值計(jì)算回收率(結(jié)果見(jiàn)表3)。

Table3 Results of recovery and reproducibility test (n=5)

Compoundc/(μg/mL)RSD within day/%Inter-day RSD/%Average recovery/%Ketamine0.054.215.35103.440.201.652.33101.261.003.774.26102.18Norket-amine0.055.696.32101.850.202.313.6699.861.004.786.46104.38MDMA0.056.808.1797.190.203.685.0699.321.007.328.96102.88MDA0.054.796.2898.270.202.963.95101.631.008.559.13105.44

2.4 樣品分析

據(jù)文獻(xiàn)文獻(xiàn)[5-6]報(bào)道，大鼠以氯胺酮290 mg/kg灌胃給藥后，出現(xiàn)急性中毒現(xiàn)象，大鼠灌胃給藥150 mg/kg MDMA后，也同樣出現(xiàn)急性中毒。根據(jù)現(xiàn)在毒品的吸食模式，綜合考慮動(dòng)物生命周期，取喂食“K粉”與“搖頭丸”粉末(“搖頭丸”研磨成粉狀)(氯胺酮按280 mg/kg灌胃，MDMA按140 mg/kg灌胃)的急性中毒大鼠24 h內(nèi)自然排泄尿液樣品5 mL，按以上所述試驗(yàn)方法進(jìn)行檢驗(yàn)，檢材中分別出現(xiàn)與對(duì)照品相對(duì)應(yīng)的質(zhì)譜圖，因此可認(rèn)定檢材中存在氯胺酮、去甲氯胺酮、MDMA和MDA 4種成分。進(jìn)一步測(cè)定得出該尿液樣本中的氯胺酮、去甲氯胺酮、MDMA和MDA的含量分別為2.02、3.01、1.05、1.98 μg/mL。

3 結(jié) 論

本試驗(yàn)采用SPME-HPLC-MS法對(duì)尿液中的“K粉”與“搖頭丸”混合毒品及其體內(nèi)主要代謝產(chǎn)物進(jìn)行了定性和定量分析，本方法操作便捷，結(jié)果準(zhǔn)確，可為公安機(jī)關(guān)對(duì)吸毒嫌疑人的尿液等生物樣品進(jìn)行檢測(cè)提供新的方法，為公安機(jī)關(guān)打擊毒品犯罪提供法庭證據(jù)。