萬南燕，蔣翠花，高 萌，張 健，殷志琦，潘 珂

(1中國藥科大學中藥學院天然藥物化學系，南京 210009；2江蘇省中醫(yī)藥研究院轉(zhuǎn)化醫(yī)學實驗室，南京 210028；3南京中醫(yī)藥大學附屬中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院 南京 210028；4中國藥科大學中藥學院中藥制藥系&天然藥物活性組分與藥效國家重點實驗室，南京 210009)

肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是世界上最常見和最具侵襲性的腫瘤之一[1-2]。盡管多激酶抑制劑在分子治療方面取得了進展，但晚期HCC的預后仍然很差，5年生存率為3%～11%[3]。免疫逃逸是腫瘤發(fā)展的重要因素，程序性死亡配體1(PD-L1)的過度表達參與腫瘤的免疫逃逸，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預后不良密切相關(guān)[2,4]。PD-L1是PD-1的配體，在腫瘤細胞和免疫細胞上均表達，而PD-1主要在活化的T細胞上表達。PD-L1與PD-1的結(jié)合通過誘導T細胞的衰竭和凋亡來抑制T細胞效應功能，導致免疫抑制狀態(tài)[5]。研究表明PD-L1/PD-1信號通路在T細胞介導的腫瘤免疫應答中發(fā)揮重要作用，且針對PD-1/PD-L1的治療性阻斷已經(jīng)證實可以使部分腫瘤患者具有持久的抗腫瘤反應[6-7]。目前HCC的免疫治療試驗已發(fā)現(xiàn)組織學證實的腫瘤自發(fā)性消退，但患者反應率相對較低，并且基于抗體檢查點抑制劑的不良反應和高成本限制了其應用[8-9]。近年來，小分子抑制劑的研究逐步興起，天然小分子對PD-L1調(diào)控的研究也取得了一定進展，挖掘潛在干擾PD-1/PD-L1表達的天然小分子可能是腫瘤治療的新領(lǐng)域[10-11]。

芍藥苷(paeoniflorin)是一種單萜葡萄糖苷，作為天然植物藥被廣泛使用。芍藥苷具有抗炎、鎮(zhèn)痛、免疫調(diào)節(jié)、肝臟和神經(jīng)保護、認知障礙改善和抗高血糖效應等藥理作用[12-13]。近年來臨床前研究表明芍藥苷對非小細胞肺癌、胃癌、肝癌和白血病等發(fā)揮抗腫瘤活性[14-15]，可通過調(diào)控PI3K/AK、JAK/STAT3、NF-κB等多種通路調(diào)節(jié)機體免疫功能，抑制腫瘤生長[16-17]。因此，推測芍藥苷可能通過JAK/STAT3通路調(diào)節(jié)PD-L1，參與腫瘤患者的免疫調(diào)控系統(tǒng)，增強抗腫瘤免疫應答。因此，本研究擬通過IFN-γ誘導的HepG2細胞模型探究芍藥苷對PD-L1的調(diào)節(jié)作用及其作用機制。

1 材 料

1.1 藥品與試劑

芍藥苷(HPLC面積歸一化法測定純度大于99%，四川維克奇生物科技有限公司)；胎牛血清(美國Hyclone公司)；DMEM、胰蛋白酶、噻唑蘭MTT(江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司)；牛血清白蛋白(BSA)、IFN-γ(美國R&D公司)；PD-L1 ELISA檢測試劑盒(美國Protintech公司)、IL-2 ELISA檢測試劑盒(美國Novus公司)；PHA、PMA、Ruxolitinib(美國Sigma公司)；BCA蛋白定量試劑盒(南京建成生物工程研究所)；二甲基亞砜DMSO、RIPA裂解液、PMSF、Anti-PD-L1抗體(美國Cell Signaling Technology公司)；Trizol(美國Life Technologies公司)，引物、DEPC水(上海捷瑞生物工程有限公司)；SYBR Green Real-time PCR Master Mix、ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Remover[東洋紡(上海)生物科技有限公司]；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀 器

全波長多功能酶標儀(美國賽默飛世爾科技有限公司)；超速控溫離心機(美國Beckman Coulter公司)；熒光倒置顯微鏡(德國Carl Zeiss公司)；A101439電泳儀、QuantStudioTMDx Real-Time PCR循環(huán)儀(美國Bio-Rad公司)。

1.3 細胞株

人肝癌細胞株HepG2購自上海ATCC細胞庫。HepG2細胞用含10% FBS的高糖DMEM培養(yǎng)液，在37 ℃、體積分數(shù)5% CO2的飽和濕度條件下培養(yǎng)，每隔3天用0.25%胰蛋白酶消化細胞，按1∶3比例進行傳代，取對數(shù)期的細胞用于實驗[18]。

2 方 法

2.1 PD-L1高表達模型建立和藥物溶解

IFN-γ 100 μg用去離子水500 μL溶解為0.2 mg/mL母液，然后用PBS稀釋為400 ng/mL儲備液，0.22 μm濾膜過濾待用。

取一定量的芍藥苷，先用DMSO溶解至一定濃度，使DMSO濃度不超過藥物最終使用濃度的0.1%，然后用DMEM稀釋至相應濃度。

2.1.1 ELISA檢測IFN-γ對HepG2細胞PD-L1表達的影響 取對數(shù)生長期HepG2細胞，以每孔1×106個細胞接種于6孔板中，細胞貼壁后分別給予含有10、20、30 ng/mL IFN-γ的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后，裂解細胞后收集上清液，用ELISA試劑盒測定上清液中PD-L1的含量。同時抽提各孔細胞總蛋白，采用BCA定量試劑盒檢測蛋白濃度，以較正PD-L1濃度。

2.1.2 Real-time PCR檢測IFN-γ對HepG2細胞PD-L1表達的影響 HepG2細胞按照“2.1.1”項下方法處理后，PBS清洗細胞2次，用Trizol試劑提取細胞RNA，酶標儀測定A260/280及其濃度。RNA在65 ℃條件下熱變性5 min后，立即置于冰上，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明配制體系，使RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應參數(shù)分別為：37 ℃，15 min；50 ℃，5 min；98 ℃，5 min。按照PCR試劑盒配制反應體系后進行反應，反應參數(shù)為95 ℃，15 s；60 ℃，15 s；72 ℃，45 s。其中，95 ℃預變性60 s；共循環(huán)40次[19]。測得基因引物序列見表1。

2.1.3 流式細胞術(shù)檢測IFN-γ對HepG2細胞PD-L1表達的影響 HepG2細胞按照“2.1.1”項下方法處理后，用預冷的PBS清洗細胞兩次，之后用胰酶消化收集離心后棄去上清液，細胞用0.1% BSA稀釋的一抗稀釋液(兔抗，1∶400) 100 μL重新懸浮，孵育1 h后，離心去上清液，用預冷PBS清洗兩遍后，加入用0.1% BSA稀釋的二抗稀釋液(抗兔，1∶8 000) 100 μL重新懸浮，孵育40 min后，離心去上清液，用預冷PBS清洗兩遍，加入PBS 50 μL重新懸浮后，用流式細胞術(shù)檢測PD-L1蛋白的表達。

2.2 MTT法檢測芍藥苷對HepG2細胞的活性的影響

取生長狀態(tài)良好的HepG2細胞，消化后以每孔1×104個細胞的密度接種于96孔板中，待細胞貼壁后吸去培養(yǎng)基，加入不含血清的DMEM饑餓8 h后，分別給予1，5，10，20，40 μmol/L的芍藥苷，空白組加入不含血清的DMEM，孵育24 h后吸去培養(yǎng)基，每孔加入含5 mg/mL MTT的空白培養(yǎng)基100 μL，孵育4 h，吸去上清液，每孔加入DMSO 150 μL，酶標儀測定490 nm處的吸收度，計算細胞活力，實驗平行3次。

2.3 檢測芍藥苷對HepG2細胞PD-L1表達的影響

2.3.1 ELISA檢測芍藥苷對HepG2細胞PD-L1表達的影響 取對數(shù)生長期HepG2細胞，以每孔1×106個細胞接種于6孔板中，分別設(shè)置空白組(Control)、模型組(Model)和芍藥苷給藥組(20 μmol/L)?？瞻捉M每孔加入空白DMEM培養(yǎng)基，模型組每孔加入30 ng/mL IFN-γ的DMEM培養(yǎng)基，給藥組每孔分別加入30 ng/mL IFN-γ和20 μmol/L 芍藥苷的DMEM培養(yǎng)基，孵育24 h后，裂解細胞后收集上清液，用ELISA試劑盒測定上清液中PD-L1的含量。同時抽提各孔細胞總蛋白，采用BCA定量試劑盒檢測蛋白濃度，以較正PD-L1濃度。

2.3.2 Real-time PCR檢測芍藥苷對HepG2細胞PD-L1表達的影響 HepG2細胞按照“2.3.1”項下方法處理后，PBS清洗細胞2次，用Trizol試劑提取細胞RNA，酶標儀測定A260/280及其濃度。RNA在65 ℃條件下熱變性5 min后，立即置于冰上，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明配制體系，使RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應參數(shù)分別為：37 ℃，15 min；50 ℃，5 min；98 ℃，5 min。按照PCR試劑盒配置反應體系后進行反應，反應參數(shù)為95 ℃，15 s；60 ℃，15 s；72 ℃，45 s。其中，95 ℃預變性60 s；共循環(huán)40次。測得基因引物序列見表1。

Table1 Primer sequence for real-time PCR assay

GenePrimer sequencePD-L1Forward 5'-GGTGCCGACTACAAGCGAAT-3'Reverse 5'-AGCCCTCAGCCTGACATGTC-3'GAPDHForward 5'-ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG-3'Reverse 5'-GCCATCACGCCACAGTTTC-3'

2.3.3 流式細胞術(shù)檢測芍藥苷對HepG2細胞PD-L1表達的影響 HepG2細胞按照“2.3.1”項下方法處理后，用預冷的PBS清洗細胞2次，之后用胰酶消化收集離心后棄去上清液，細胞用0.1% BSA稀釋的一抗(1∶400) 100 μL重新懸浮，孵育1 h后，離心去上清液，用預冷PBS清洗兩遍后，加入用0.1% BSA稀釋的二抗(1∶800) 100 μL重新懸浮，孵育40 min后，離心去上清液，用預冷PBS清洗兩遍，加入PBS 50 μL重新懸浮后，用流式細胞儀檢測PD-L1蛋白的表達。

2.4 T細胞和HepG2細胞共培養(yǎng)

取對數(shù)生長期HepG2細胞，以每孔1×105個接種于12孔板中，分別設(shè)置空白組(Control)、模型組(Model)和芍藥苷給藥組(20 μmol/L)。給藥后1 h加IFN-γ，孵育24 h 后，用PBS清洗兩遍后，Jurkat細胞按照每孔8×105個細胞加入孔中，加入10 μg/mL PHA+10 ng/mL PMA孵育24 h后，收集上清液和Jurkat細胞，1 000 r/min離心5 min,分別檢測Jurkat細胞活性和上清液中IL-2的濃度。

2.5 Western blot分析

取對數(shù)生長期HepG2細胞，以每孔1×106個接種于6孔板中，分別設(shè)置空白組(Control)、模型組(Model)、芍藥苷給藥組(20 μmol/L)和抑制劑組?？瞻捉M每孔加入空白DMEM培養(yǎng)基，模型組每孔加入30 ng/mL IFN-γ的DMEM培養(yǎng)基，給藥組每孔分別加入30 ng/mL IFN-γ和20 μmol/L芍藥苷的DMEM培養(yǎng)基，孵育24 h后，PBS清洗細胞兩次，用細胞刮刮取細胞，收集后300 r/min離心5 min，分別加蛋白裂解液60 μL在冰上裂解30 min，吹打細胞數(shù)次，收集裂解液，12 000 r/min離心15 min，收集上清液，用BCA試劑盒測定總蛋白濃度。將蛋白質(zhì)樣品稀釋至相同且合適的濃度進行SDS-PAGE電泳(電泳參數(shù)：85 V、20 min；120 V、80 min)，然后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上在5%脫脂奶粉封閉液中室溫封閉1 h，加入一抗(1∶1 000)于4 ℃過夜，后加入二抗(1∶2 000)室溫孵育2 h，采用電化學發(fā)光檢測法(ECL法)顯色。對感光膠片條帶進行灰度分析，以目的條帶與內(nèi)參照條帶GAPDH的比值代表目的蛋白的相對表達量。

2.6 數(shù)據(jù)分析

3 結(jié) 果

3.1 HepG2細胞PD-L1高表達模型的建立

IFN-γ刺激HepG2細胞24 h后，ELISA檢測結(jié)果顯示：30 ng/mL IFN-γ對于PD-L1的上調(diào)作用最為明顯(圖1)，PCR檢測結(jié)果證明IFN-γ對于PD-L1 mRNA的上調(diào)呈現(xiàn)劑量依耐性(圖2)，流式細胞術(shù)檢測結(jié)果也進一步證明了這個結(jié)論(圖3)。

3.2 芍藥苷對HepG2細胞活力的影響

通過MTT檢測不同濃度的芍藥苷對HepG2細胞存活率的影響。如圖4顯示，與正常對照組相比，1、5、10、20 μmol/L的芍藥苷處理后的細胞活力明顯大于90%，無明顯細胞毒性，故選擇20 μmol/L芍藥苷作為藥物安全濃度開展后續(xù)實驗。

3.3 芍藥苷對HepG2細胞PD-L1表達的影響

如圖5所示，與正常對照組相比，模型組細胞PD-L1的表達水平顯著增加。加入芍藥苷后，PD-L1的表達受到抑制。ELISA檢測PD-L1與流式細胞術(shù)檢測結(jié)果一致(圖6)，30 ng/mL IFN-γ處理的細胞PD-L1的蛋白和mRNA表達水平顯著增加。與模型組相比，給予20 μmol/L的芍藥苷24 h后，給藥組HepG2細胞的PD-L1蛋白和mRNA的表達水平顯著降低(圖7)。

Figure3 Effect of IFN-γ on PD-L1 protein expression of HepG2 cells.HepG2 cells were treated with different concentration of IFN-γ for 24 h,and then PD-L1 was measured by flow cytometry
A：Control group；B：HepG2 cell treated with 10 ng/mL IFN-γ；C：HepG2 cell treated with 20 ng/mL IFN-γ；D：HepG2 cell treated with 30 ng/mL IFN-γ

Figure5 Effect of IFN-γ on PD-L1 protein expression of HepG2 cells.HepG2 cells were treated with different concentration of IFN-γ for 24 h,and then PD-L1 was measured by flow cytometry
A:Control group;B:HepG2 cell treated with 30 ng/mL IFN-γ;C:HepG2 cell treated with 20 μmol/L paeoniflorin in the absence or presence of 30 ng/mL IFN-γ for 24 h

3.4 芍藥苷對共培養(yǎng)體系中T細胞IL-2分泌的影響

為了檢測芍藥苷是否能夠逆轉(zhuǎn)PD-L1高表達的HepG2細胞對表達PD-1細胞的T細胞的抑制作用，將IFN-γ刺激的PD-L1高表達的HepG2細胞用芍藥苷20 μmol/L處理24 h后，與激活的Jurkat T細胞共孵育，24 h后分別收集上清和Jurkat T細胞，檢測IL-2的分泌水平和T細胞的增殖情況。如圖8和9所示，模型組較空白組，HepG2高表達PD-L1，顯著抑制T細胞的增殖活性，IL-2的分泌也受到抑制。加藥組與模型組相比，芍藥苷顯著逆轉(zhuǎn)了高表達PD-L1的HepG2細胞對高表達PD-1的T細胞的細胞增殖抑制作用，T細胞增殖活性顯著增強，IL-2的分泌水平也顯著提高。

3.5 芍藥苷對HepG2細胞中PD-L1、JAK和STAT3磷酸化水平的影響

與正常組相比，IFN-γ刺激下的模型組的PD-L1、JAK和STAT3的表達水平均顯著上升。芍藥苷干預后，PD-L1的表達顯著降低，與抑制劑作用結(jié)果類似。JAK、STAT3的磷酸化水平在芍藥苷作用后均有所降低(圖10)。

4 討 論

腫瘤免疫逃逸是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要原因之一，PD-L1表達上調(diào)是腫瘤細胞的常見免疫逃避策略[20]，并預示著腫瘤治療的預后不良。本研究采用IFN-γ刺激HepG2細胞24 h，成功建立PD-L1高表達模型，評價天然小分子芍藥苷對PD-L1的調(diào)控作用。實驗結(jié)果證實芍藥苷能夠顯著降低PD-L1的表達，降低JAK、STAT3的磷酸化水平，提示芍藥苷可能通過JAK/STAT3通路抑制PD-L1的表達，從而改善腫瘤免疫逃逸。

目前，靶向免疫檢查點PD-1/PD-L1和CTLA-4的抗體治療晚期肝細胞癌的臨床試驗正在進行中，PD-1/PD-L1抗體nivolumab在晚期HCC中的Ⅰ/Ⅱ期試驗中顯示出有利的結(jié)果，目前正在進行兩項Ⅲ期研究比較PD-1/PD-L1抗體和激酶抑制劑索拉非尼在HCC患者一二線治療療效，臨床前研究數(shù)據(jù)明確了免疫檢查點抑制劑在腫瘤治療中的發(fā)展前景[23]，結(jié)果表明，抗PD-1抗體與局部治療或其他靶向分子相結(jié)合藥物是HCC的有效治療策略。因此，免疫檢查點抑制劑可以為HCC的治療打開新的大門。但PD-1/PD-L1檢查點抑制劑的高昂價格和所引起的嚴重免疫相關(guān)副反應限制了其在HCC中的應用。研究發(fā)現(xiàn)，天然小分子化合物如芹菜素、人參皂苷Rg3、雷公藤甲素、青藤堿等均能抑制PD-L1的表達，顯示了天然小分子下調(diào)PD-L1表達的潛力。

已有研究表明，實體瘤可通過上調(diào)腫瘤微環(huán)境中的IFN-γ誘導PD-L1表達，從而抑制抗腫瘤免疫應答[5,24]。例如，肝細胞瘤細胞系(HepG2，Hep3B和PLC)暴露于IFN-γ或IFN-α后PD-L1的表達顯著增加[25]。本研究發(fā)現(xiàn)采用IFN-γ刺激HepG2細胞，PD-L1蛋白和mRNA表達顯著增加，說明模型成立。文獻報道PD-1/PD-L1相互作用，引起T細胞凋亡和耗竭，抑制T細胞分泌IL-2，從而減弱T細胞對腫瘤細胞的抑制作用，促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展[26]。本研究結(jié)果顯示，HepG2細胞經(jīng)IFN-γ刺激后高表達PD-L1，與活化的Jurkat細胞表達的PD-1結(jié)合，Jurkat細胞活性顯著下降，其分泌的IL-2較空白組相比顯著降低。加入芍藥苷干預后，T細胞增殖顯著增強，IL-2的分泌水平較模型組也顯著增加。由此說明芍藥苷能夠通過抑制PD-L1的表達，從而逆轉(zhuǎn)PD-L1與PD-1結(jié)合后對T細胞活性的抑制作用。

JAK/STAT3信號通路對免疫反應、細胞生長和分化等都發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。細胞因子和生長因子與激活非受體酪氨酸激酶JAK的膜受體結(jié)合，STAT轉(zhuǎn)錄因子被活化的JAK磷酸化并二聚化，后入核與相應DNA片段結(jié)合，調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄[27]。STAT3作為腫瘤發(fā)生過程中的癌蛋白已被廣泛研究，其信號轉(zhuǎn)導通路的不斷激活與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[28-29]。JAK/STAT3通路在多種癌癥中被證明與PD-L1的表達調(diào)控密切相關(guān)，STAT3能結(jié)合到PD-L1啟動子區(qū)域從而調(diào)控PD-L1的表達[30]。文獻研究證實芍藥苷可通過調(diào)控STAT3表達抑制人膠質(zhì)瘤細胞、胃癌細胞等腫瘤細胞增殖[16-17]。本研究發(fā)現(xiàn)芍藥苷能顯著降低IFN-γ誘導的HepG2細胞的PD-L1的高表達，降低細胞內(nèi)JAK、STAT3的磷酸化水平，進一步提示芍藥苷具有通過抑制JAK/STAT3信號通路達到抑制PD-L1表達的作用。

綜上所述，芍藥苷可能通過JAK/STAT3通路抑制PD-L1表達，從而發(fā)揮改善腫瘤免疫逃逸的作用，但仍需體內(nèi)實驗進一步驗證。