周 敏，高慧新，封 毅，曾昭清，田 慧

(廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，南寧 530002)

白花蛇舌草HedyotisdiffusaWilld.是茜草科Rubiaceae耳草屬Hedyotis植物，是壯族民間常用中草藥，在《廣西壯族自治區(qū)壯藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》[1]和《中華人民共和國藥典》[2]中均有收載，內(nèi)服多用于治療小兒疳積、胃痛、肝炎、腫瘤，外用治療毒蛇咬傷，泡瘡、刀傷、跌打等癥。隨著分子標(biāo)記技術(shù)的快速發(fā)展，越來越多學(xué)者利用分子標(biāo)記對物種遺傳多樣性進行研究。常見的分子標(biāo)記有隨機引物擴增DNA多態(tài)性(random amplified polymorphism DNA,RAPD)、擴增片段長度多態(tài)性(amplified fragrment length polymorhism,AFLP)、限制性片段長度多態(tài)性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)、簡單重復(fù)序列(simple sequence repeat,SSR)和簡單重復(fù)序列區(qū)間(inter-simple sequence repeat，ISSR)標(biāo)記技術(shù)等。ISSR是由加拿大學(xué)者Zietkiewicz等[3]于1994年在PCR的基礎(chǔ)上創(chuàng)建的分子標(biāo)記技術(shù)。其原理為：在SSR的5′或3′端錨定2～4個隨機堿基作為引物，引物能在特異位點退火。ISSR分子標(biāo)記具有多態(tài)性高、重復(fù)高、穩(wěn)定性好、操作方便及成本低等優(yōu)點。近年來已有很多學(xué)者利用ISSR分子標(biāo)記對物種的遺傳多樣性及其真?zhèn)舞b定[4-6]。基于此，本文研究將利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對采集不同省份共23份的白花蛇舌草進行遺傳多樣性研究，以期為白花蛇舌草的分類鑒定提供了理論依據(jù)。

1 樣品采集

本研究共23份白花蛇舌草樣品的采集分別來自廣西壯族自治區(qū)、廣東省、湖南省、浙江省、福建省、江西省和安徽省7個省區(qū)，樣品采集后立刻裝入含硅膠的密封袋中，并勤換硅膠，直至樣品干燥完全。所采集的樣品經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)馬雯芳副教授鑒定，為茜草科耳草屬植物白花蛇舌草HedyotisdiffusaWilld。樣品保存于廣西中醫(yī)藥大學(xué)壯瑤藥協(xié)同創(chuàng)新中心樣品儲存室-20 ℃冰箱，備用。樣品采集信息見表1。

Table1HedyotisdiffusaWilld.samples for ISSR analysis

Sample numberCollecting locationCollecting time (Y/M/D)Population province1Yongning District,Nanning City2016/06/25Guangxi2Guangxi Medical Botanical Garden2016/07/09Guangxi3Qingxiu District,Nanning City2016/06/30Guangxi4Longsheng County,Guilin City2016/10/05Guangxi5Rong'an County,Liuzhou City2016/05/25Guangxi6Rongshui County,Liuzhou City2016/06/20Guangxi7Qinbei District,Qinzhou City2016/06/30Guangxi8Fangcheng Port District,Fangchenggang City2016/03/23Guangxi9Pingnan District,Guigang City2016/06/15Guangxi10Xingye County,Yulin City2016/06/12Guangxi11Jingxi County,Baise City2016/06/09Guangxi12Zhaoping District,Hezhou City2016/06/10Guangxi13Zengcheng District,Guangzhou City2016/06/15Guangdong14Gaozhou City,Maoming City2016/06/14Guangdong15Ruian City,Wenzhou City2016/06/15Zhejiang16Wanli District,Nanchang City2016/07/06Jiangxi17Xianju County,Taizhou City2016/07/12Zhejiang18Xiuning County,Huangshan City2016/07/14Anhui19Nankang District,Zhangzhou City2016/07/23Jiangxi20Anren County,Chenzhou City2016/06/16Hunan21Huayao County,Yongzhou City2016/07/08Hunan22Tong'an District,Xiamen City2016/07/06Fujian23Gutian County,Ningde City2016/07/06Fujian

2 材 料

2.1 試 劑

DNA提取試劑盒、RNase、D2000 DNA Marker(天根生化科技有限公司)；GelRed染料(美國Biotium 公司)；瓊脂糖(美國英杰生命技術(shù)有限公司)。

2.2 儀 器

高速冷凍離心機(德國賽默飛世爾公司)；手掌型離心機(江蘇海門市麒麟醫(yī)用儀器廠)；梯度PCR儀、電泳儀(美國Bio-Rad公司)；凝膠成像儀(美國Gel Logic公司)；超純水一體機(美國Millipore公司)。

3 方 法

3.1 DNA的提取

對所有樣品進行總DNA的提取，方法依照按照天根植物總DNA提取試劑盒操作步驟，將提取的總DNA分裝至-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

3.2 引物的合成與篩選

實驗所用150條引物，其中100條來自哥倫比亞大學(xué)(UBC)公布的通用引物，其余50條自設(shè)引物，根據(jù)ISSR引物設(shè)計原則：2～3個堿基簡單重復(fù)4～5次，一端或者兩端加2～4個錨定堿基。自設(shè)引物序列如表3。引物均由華大基因公司合成。用23份白花蛇舌草樣品對150條ISSR引物進行擴增篩選，PCR產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，并篩選出背景清晰、擴增效果好和多態(tài)性高的引物用于ISSR-PCR反應(yīng)；同時根據(jù)各個引物的Tm，對各個引物的最佳退火溫度進行篩選。

Table2 Self-designed primer sequence used for the ISSR amplification

PrimerPrimer sequences (5'→3')PrimerPrimer sequences (5'→3')117ATATATATATATAC162CGCCGCCGCCGCCGCTC118ATATATATATATCG169CTCTCTCTCTCTTG119GTGTGTGTGTGTGC170CTCTCTCTCTCTAC120GTGTGTGTGTGTGCC171CTCTCTCTCTCTGC121ACACACACACACTC172CACACACACACACACATC122ACACACACACACTCT173CACACACACACAAT123ACACACACACACTG174CACACACACACAAG124ACACACACACACTGG175CACACACACACAGC125CTCTCTCTCTCTAG182GTGGTGGTGGTGGTGAC126CTCTCTCTCTCTAGA183GTGGTGGTGGTGGTGAT127ATAATAATAATATC184GTGGTGGTGGTGGTGAG128ATAATAATAATATCA185GTGGTGGTGGTGGTGCT129ATAATAATAATACT186GTGGTGGTGGTGGTGTG130ATAATAATAATAATACG187GTGGTGGTGGTGGTGCG131CTCATCATCATCATCTA101ACACACACACACCGC132CTACTACTACTACTAAC102ACACACACACACCGG133TATTATTATTATTATTA103ACACACACACACCGA146GTCGTCGTCGTCGC104ACACACACACACCGT148TGTGTGTGTGTGCT105ATATATATATATACA150CACACACACACACT106ATATATATATATACT151ACACACACACACGT107GTGTGTGTGTGTGCG156ACACACACACACCT108GTGTGTGTGTGTGCC157ACACACACACACCG109TGTGTGTGTGTGCTA160GATGATGATGATGC110TGTGTGTGTGTGCTG161CGCCGCCGCCGCTG111CTCTCTCTCTCTAGA

3.3 PCR擴增

ISSR-PCR反應(yīng)體系設(shè)置為：PCR反應(yīng)體系的體積為20 μL，2×TaqPCR Mastermix 10 μL，正反引物各0.5 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 8 μL。ISSR-PCR擴增程序為：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，退火30 s(不同引物Tm決定)，72 ℃延伸2 min，30個循環(huán)，72 ℃延伸5 min,4 ℃保存。

3.4 電泳檢測

取PCR產(chǎn)物8 μL用1.2%的瓊脂糖凝膠(含GelRed染料)電泳，電壓75 V，電泳50 min，用D2000 DNA Marker作為標(biāo)準(zhǔn)參照。電泳結(jié)束后，在紫外凝膠成像儀中觀察并拍照保存。

3.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

ISSR為顯性標(biāo)記，同一引物擴增產(chǎn)物中電泳遷移率一致的條帶被認(rèn)為是同一位點的產(chǎn)物[7]。對凝膠電泳圖進行分析，同一位點有相同的擴增條帶記為“1”，無則記為“0”，從而得到“1”、“0”矩陣圖[8]。采用POPGENE1.32、NTSYS2.10軟件對白花蛇舌草的ISSR-PCR數(shù)據(jù)進行歸類和分析。利用POPGENE1.32計算有效等位基因(Ne)、等位基因數(shù)(Na)、Shannon′s信息指數(shù)(I)、Nei′s基因多樣性指數(shù)(H)等遺傳多樣性參數(shù)，以及居群內(nèi)基因多樣性(Hs)、居群總基因多樣度(Ht)、居群間遺傳分化系數(shù)(Gst)以及基因流(Nm)等遺傳分化指標(biāo)。其中Ne值越大，說明等位基因越重要，等位基因作用越大。I和H越大，說明該樣品遺傳多樣性水平越高。最后利用NTSYS2.10軟件做聚類分析圖。

4 結(jié) 果

4.1 引物的篩選

本實驗從150條引物中篩選出11條重復(fù)性好、條帶清晰且多態(tài)性高的引物，其中從通用引物篩選出7條，自設(shè)引物篩選出4條，可用于白花蛇舌草遺傳多樣性分析。為取得較好的實驗結(jié)果，本研究對已篩選的11條引物的退火溫度進行優(yōu)化，各個引物的序列及篩選出的最佳退火溫度如表3，部分?jǐn)U增圖見圖1。

4.2 不同產(chǎn)地的白花蛇舌草遺傳多樣性分析

由表4可知，廣西產(chǎn)白花蛇舌草的Ne、H和I均最大，分別為1.535 5、0.300 2和0.438 1，說明廣西產(chǎn)白花蛇舌草等位基因作用最大、遺傳多樣性最高。由整體樣本的物種水平可知，白花蛇舌草的Na為1.852 2，Ne為1.543 4，H為0.316 5，I為0.470 0。

Table3 Primers used for the inter simple sequence repeat (ISSR) amplification,and its annealing temperature and number of the amplified bands

PrimerPrimer sequence (5'→3')Annealing temperature/℃Amplified number of bandsNumber of polymorphic bandsProportion of polymorphic bands(PPB)/%UBC825ACA CAC ACA CAC ACA CT48.999100.00UBC826ACA CAC ACA CAC ACA CC51.29777.78UBC827ACA CAC ACA CAC ACA CG46.98562.50UBC842GAGAGAGAG AGA GAG AYG50.3131184.61UBC856ACA CAC ACA CAC ACA CYA51.58787.50UBC881GGG TGG GGT GGG GTG53.2141392.86UBC885BHB GAG AGA GAG AGA GA52.69555.56121ACACACACACACTC51.6141392.86156ACACACACACACCT48.9131292.30157ACACACACACACCG52.610990.00160GATGATGATGATGC54.28787.50

Figure1 PCR amplification electrophoresis of primer 157.M represent marker.The sample number 1-23 were shown in Table 1

Table4 Genetic diversity coefficients of the Hedyotis diffusa Willd.populations

PopulationNumber of alleles (Na)Number of effective alleles (Ne)Nei's index (H)Shannon's index (I)Number of polymorphic bandsProportion of polymorphic bandsGuangxi1.756 51.535 50.300 20.438 18775.65Guangdong1.304 31.215 20.126 10.184 03530.43Zhejiang1.234 81.166 00.097 30.142 02723.48Jiangxi1.304 31.215 20.126 10.184 03530.43Anhui1.000 01.000 00.000 00.000 000Hunan1.139 11.098 40.057 60.084 11613.91Fujian1.147 81.104 50.061 20.089 41714.78Species level1.852 21.543 40.316 50.470 09885.22

4.3 白花蛇舌草遺傳分化的分析

采用POPGENE1.32軟件對不同省份的白花蛇舌草進行遺傳分化分析，結(jié)果見表5，不同產(chǎn)地白花蛇舌草的居群總基因多樣度(Ht)為0.289 6，居群內(nèi)基因多樣性(Hs)為0.109 8，居群間遺傳分化系數(shù)(Gst)為0.620 9。其中Gst>Hs，說明居群間遺傳分化度比居群內(nèi)遺傳分化度更高?；蛄?Nm)為0.305 2<1，說明居群間遺傳分化水平較低，不同產(chǎn)地居群間基因交流較少。

Table5 Coefficients of the genetic diversity and gene flow within and among theHedyotisdiffusaWilld.populations

Total Sample number Total genetic diversity among populations(Ht)Genetic diversitywithin a population(Hs)Genetic Diversity index among populations(Gst)Gene flow among populations (Nm)230.289 60.109 80.620 90.305 2

4.4 白花蛇舌草遺傳距離的分析

采用POPGENE1.32軟件對不同省份的白花蛇舌草的遺傳距離進行分析，白花蛇舌草的Nei′s遺傳相似度和Nei′s遺傳距離，由表6可知。7個不同省份的白花蛇舌草遺傳相似度在0.668 3～0.852 2，遺傳距離在0.160 0～0.403 0，說明7個不同省份的白花蛇舌草遺傳相似度較高，遺傳距離較近；其中，浙江和廣西的遺傳相似度為0.852 2，遺傳相似度最高；安徽和福建的遺傳相似度為0.668 3，遺傳相似度最低。浙江和廣西的遺傳距離為0.160 0，遺傳距離最小；安徽和福建的遺傳距離為0.403 0，遺傳距離最大。

Table6 Genetic identity (above diagonal) and genetic distance (below diagonal) among differentHedyotisdiffusaWilld.populations

PopulationGuangxiGuangdongZhejiangJiangxiAnhuiHunanFujianGuangxi/0.813 00.852 20.845 30.765 60.817 20.777 4Guangdong0.207 0/0.775 40.753 40.728 30.724 10.729 9Zhejiang0.160 00.254 4/0.816 20.701 40.806 70.801 6Jiangxi0.168 00.283 20.203 1/0.802 70.791 80.722 6Anhui0.267 10.317 10.354 70.219 8/0.671 80.668 3Hunan0.201 80.322 90.214 80.233 40.397 8/0.784 1Fujian0.251 80.314 80.221 20.324 90.403 00.243 3/

4.5 不同產(chǎn)地白花蛇舌草的NTSYS聚類分析

采用NTSYS2.10軟件對23份不同產(chǎn)地的白花蛇舌草進行聚類分析，見圖2。遺傳相似度在0.68(Ⅰ)，可將白花蛇舌草分成3大類：第1類包括19份樣品，多為廣西壯族自治區(qū)樣品；第2類為柳州融水，第3類包括3份樣品，來自廣東茂名、安徽黃山和江西南昌。遺傳相似度在0.73(Ⅱ)，可將第1類分為4個亞類，第1亞類包括廣西中醫(yī)藥大學(xué)、江西南昌、浙江臺州、廣西桂林和柳州融安共5份樣品；第2亞類包括廣西欽州、防城港、貴港、玉林、玉林、賀州，廣東茂名和浙江溫州共8份樣品；第3亞類包括廣西藥用植物園和廣西青秀區(qū)2份樣品。第4亞類包括湖南郴州、永州和福建廈門、寧德共4份樣品。第3類分為2個亞類，廣東廣州歸為一類，安徽黃山和江西贛州歸為另一類。由上可知，廣西壯族自治區(qū)樣品大部分聚在一起，湖南和福建的樣品聚在一起；欽州樣品和防城港市樣品親緣關(guān)系最近，可能因為地理位置相毗鄰，故遺傳距離較近，說明大部分的樣品的遺傳多樣性和地理位置有關(guān)。柳州融水的樣品與其它廣西地區(qū)的樣品親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，可能是因為融水采集的樣品在偏遠(yuǎn)山區(qū)，與其它的樣品無法進行基因交流；廣東茂名的樣品與廣西壯族自治區(qū)樣品聚在一類，未與廣東廣州樣品聚在一類，可能是因為廣東茂名離廣西地理位置相近，氣候等與廣西相近，與廣西樣品基因交流多；江西南昌與浙江臺州樣品與廣西產(chǎn)白花蛇舌草聚在一類，可能是因為二者皆采自旱地，葉片偏革質(zhì)，與廣西采樣品性狀相近。

5 討 論

物種的遺傳多樣性決定物種對環(huán)境的適應(yīng)能力和進化程度，遺傳多樣性越豐富有利于物種適應(yīng)新環(huán)境及擴展分布范圍。白花蛇舌草在中國分部范圍較廣，《中國植物志》記載[9]，產(chǎn)于廣東、廣西、海南、安徽、云南等地，多見于水田、田埂和濕潤的曠地。采集樣品時發(fā)現(xiàn)，田間等濕潤地方采集的白花蛇舌草多柔韌，葉子更寬，易掐斷；山坡及向陽處采集的白花蛇舌草多偏革質(zhì)。形態(tài)變異的本質(zhì)是基因的變異，不同地區(qū)的白花蛇舌草形態(tài)不盡相同，本研究通過ISSR分子標(biāo)記對不同產(chǎn)地的白花蛇舌草進行分析得，白花蛇舌草遺傳分化水平較高，對不同的環(huán)境適應(yīng)能力較強。影響物種遺傳變異的主要因素有：分布范圍、分類地位、種子散播機制、繁育系統(tǒng)及生活型，而在種群水平上重要性變?yōu)?繁育系統(tǒng)、分布范圍、生活型、分類地位和種子散播機制[10]。本研究白花蛇舌草居群間遺傳分化度比居群內(nèi)遺傳分化度更高?？赡苁且驗榘谆ㄉ呱嗖莩善L，居群內(nèi)基因交流較多，而居群間采樣地域跨度大，有的在山區(qū)，有的在沿海，風(fēng)媒傳播及蟲媒傳播無法進行，使得居群間交流少。本研究結(jié)果表明，ISSR分子標(biāo)記可以為白花蛇舌草的系統(tǒng)分類和鑒定提供了分子水平的理論依據(jù)。

Figure2 UPGMA dengrogram of theHedyotisdiffusaWilld.populations