王歡歡，張雷，葛瑩，宋丹丹，樓立峰，章學(xué)東

（杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，杭州 310024）

鳥嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白α亞基（guanine nucleotide binding protein subunit alpha,GNAS）是細(xì)胞膜受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的關(guān)鍵元件，它通過激活腺苷酸環(huán)化酶，可提升第二信使環(huán)腺苷酸水平，進(jìn)而影響生命活動(dòng)[1]。研究發(fā)現(xiàn)，人和小鼠的GNAS基因能夠編碼多種蛋白剪切體，其堿基突變與纖維性骨營養(yǎng)不良綜合征（McCune-Albright syndrome）（表現(xiàn)為多發(fā)性骨纖維發(fā)育不良、非隆起性皮膚褐色素沉著和性早熟等）、假性甲狀旁腺功能減退癥等疾病有關(guān)[2-3]。根據(jù) NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫中雞全基因組參考序列（版本號(hào)：Gallus_gallus-5.0），雞的GNAS基因位于第20號(hào)染色體，有10個(gè)外顯子。我們的前期研究結(jié)果表明：在雞GNAS基因5′調(diào)控區(qū)存在T2270C突變，且與膚色性狀呈顯著相關(guān)，CC基因型表現(xiàn)為膚色深黑，TT基因型表現(xiàn)為膚色淺白[4]。而查找Ensemble（http://asia.ensembl.org/index.html）數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)，雞的GNAS基因（識(shí)別號(hào)：ENSGALT 00000062075.1）有12個(gè)外顯子，在NCBI中的第1外顯子位置相當(dāng)于Ensemble數(shù)據(jù)庫中的第3外顯子位置，因此，該T2270C突變實(shí)際位于雞GNAS基因的內(nèi)含子區(qū)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)突變命名法[5]，以下改稱為c.36-2277T＞C突變。本試驗(yàn)擬在前期研究基礎(chǔ)上，構(gòu)建雞GNAS基因c.36-2277T＞C突變的不同基因型質(zhì)粒，通過檢測(cè)雙螢光素酶報(bào)告基因的表達(dá)情況，進(jìn)一步分析探討該單核苷酸多態(tài)性（singlenucleotidepolymorphism,SNP）位點(diǎn)變異對(duì)轉(zhuǎn)錄調(diào)控的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)樣本

試驗(yàn)用烏膚綠殼（black and green,BG）系烏骨雞由杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院培育保存，黑羽、烏膚。汶上蘆花雞引自山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所，蘆花羽、白膚。從翅靜脈采集這2種雞的血液樣本，用70%體積分?jǐn)?shù)乙醇固定，備用。

1.1.2 主要試劑

DNA提取試劑盒（Axygen公司，美國）；TaqDNA聚合酶、dNTPs、DNA標(biāo)志物（Takara公司，日本）；Platinum PCR SuperMix、GeneArt無縫克隆和組裝酶試劑盒混合物（Invitrogen公司，美國）；雞胚成纖維細(xì)胞（中國科學(xué)院大學(xué)細(xì)胞庫）；Endofree Plamid Maxi Kit（Qiagen公司，德國）；Turbofect轉(zhuǎn)染試劑盒（Thermo Fisher公司，美國）；雙螢光素酶報(bào)告基因分析系統(tǒng)（dual-luciferase reporter assay system,Promega公司，美國）；瓊脂糖、乙醇等為國產(chǎn)，分析純。

1.1.3 儀器設(shè)備

微量移液器、5417R高速冷凍離心機(jī)（Eppendorf公司，德國）；7900型熒光定量PCR儀（ABI公司，美國）；JY電泳儀（北京君意華鑫科技有限公司）；ChemiDoc凝膠成像系統(tǒng)（BIO-RAD公司，美國）；氣浴恒溫振蕩器（上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司）；DMi8 S倒置熒光顯微鏡（Leica公司，德國）；DHP-9052型培養(yǎng)箱（上海一恒科技有限公司）；Forma 3111二氧化碳培養(yǎng)箱（Thermo公司，美國）；GloMax發(fā)光檢測(cè)儀（Promega公司，美國）；純水儀（PALL公司，美國）；電子天平（Mettler-Toledo公司，瑞士）。

1.2 方法步驟

1.2.1 基因組DNA提取

采用Axygen血液DNA提取試劑盒提取樣本的基因組DNA。

1.2.2 c.36-2277T＞C突變檢測(cè)

根據(jù)文獻(xiàn)[4]介紹的方法檢測(cè)突變位點(diǎn)的堿基類型，選擇CC基因型和TT基因型的模板DNA進(jìn)入后續(xù)步驟。

1.2.3 c.36-2277T＞C突變點(diǎn)的重組質(zhì)粒構(gòu)建

根據(jù)雞基因組ENSGALT00000062075.1序列，設(shè)計(jì)上游引物P_F：5′-TTCTCTATCGATAGGTACC TCTGATGTGGCAGGCAGGTAA-3′，下 游 引 物P_R：5′-CTTAGATCGCAGATCTCGAGACAGATG CAGGCTCACAGGA-3′，下劃線部分分別為KpnⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction,PCR）擴(kuò)增體系為50μL：模板DNA 2.0 μL，上下游引物各1.0 μL（10 μmol/L），ddH2O 1.0μL，Platinum PCR SuperMix 45 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性2 min；94℃變性30 s，60℃退火30 s，68℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)。

將PCR產(chǎn)物回收純化，然后與pGL3 Basic載體進(jìn)行融合，融合反應(yīng)體系為10μL：純化產(chǎn)物2.0μL，pGL3Basic（50ng/μL）1.0μL，ddH2O 2.0μL，2×GeneArt酶混合物5.0μL。用限制性內(nèi)切酶KpnⅠ和XhoⅠ酶切，室溫放置20 min，冰上放置2～3 min，然后全部轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α。涂布平板培養(yǎng)基（AmpR），隨機(jī)挑選菌落，然后用盧里亞-貝爾塔尼（Luria-Bertani,LB）液體培養(yǎng)基搖床培養(yǎng)3～5 h。設(shè)計(jì)載體通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，選擇陽性菌液送往生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.4 雞胚成纖維細(xì)胞培養(yǎng)和質(zhì)粒轉(zhuǎn)染

取生長狀態(tài)良好的UMNASH/DF-1雞胚成纖維細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清（fetal bovine serum,FBS）、1%S/P雙抗的杜氏改良伊格爾培養(yǎng)基（Dulbecco’s modified Eagle medium,DMEM）中，待細(xì)胞生長至80%～90%融合時(shí)，用含0.25%乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid,EDTA）的胰酶消化細(xì)胞，然后收集細(xì)胞，離心去上清液，重懸，鋪在24孔板中培養(yǎng)至密度達(dá)到80%左右。采用Endofree Plamid Maxi Kit提取CC、TT基因型重組質(zhì)粒，以pGL3 Basic空質(zhì)粒為對(duì)照組，采用Turbofect轉(zhuǎn)染試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，每種質(zhì)粒重復(fù)做4個(gè)孔。

1.2.5 突變基因型的雙螢光素酶活性檢測(cè)

轉(zhuǎn)染6 h后更換新鮮培養(yǎng)基，按照雙螢光素酶報(bào)告基因分析系統(tǒng)的使用說明，檢測(cè)螢火蟲螢光素酶和海腎螢光素酶的表達(dá)量，其發(fā)光強(qiáng)度由GloMax發(fā)光檢測(cè)儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和生物信息學(xué)分析

采用GraphPad Prism 6.0軟件對(duì)螢光素酶活性數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)制圖，方差分析采用Tukey法。采用Promo 3.0在線軟件（http://alggen.lsi.upc.es/cgi-bin/promo_v3/promo/promoinit.cgi?dirDB=TF_8.3）進(jìn)行突變位點(diǎn)所在擴(kuò)增片段的轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 GNAS基因c.36-2277T＞C突變的測(cè)序分型

由圖1可見，c.36-2277T＞C突變位于GNAS基因第2內(nèi)含子區(qū)11 167 660 bp處。測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該位點(diǎn)存在2種基因型，蘆花雞樣本均為TT基因型，而BG系烏骨雞樣本均為CC基因型。

圖1 基因組突變位置及測(cè)序結(jié)果Fig.1 Genomic position of mutation and the sequencing results

2.2 突變重組質(zhì)粒PCR

由質(zhì)粒PCR電泳結(jié)果（圖2）可見，2種不同基因型的重組質(zhì)粒電泳條帶清晰，大小接近1 200 bp，與預(yù)期結(jié)果一致（空載體長度170 bp+外源片段長度993 bp）。陽性菌液的測(cè)序結(jié)果表明，突變點(diǎn)堿基類型符合原有判斷（TT或CC）。

圖2 質(zhì)粒PCR電泳結(jié)果Fig.2 Electrophoretic results of plasmid PCR

2.3 突變基因型的螢光素酶活性

由圖3可見，2種基因型的螢光素酶活性均顯著高于pGL3對(duì)照組，同時(shí)，CC基因型的螢光素酶活性又極顯著高于TT基因型（P＜0.000 1）。

2.4 突變點(diǎn)上下游區(qū)域的轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測(cè)

c.36-2277T＞C突變的上下游－175～+818 bp片段共993 bp，預(yù)測(cè)含有9種轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，其中以TGGCA結(jié)合蛋白位點(diǎn)數(shù)量最多，AP-1、C/EBP-alpha、T3R-alpha和NF-1其次。由圖4可見：C/EBP-alpha和TGGCA結(jié)合蛋白、ER-alpha和T3R-alpha這2對(duì)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)基本呈交錯(cuò)連接狀；而緊鄰于突變堿基的上下游轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)分別是AP-1和ER-alpha/T3R-alpha。

3 討論與結(jié)論

在體內(nèi)黑色素代謝通路中，GNAS發(fā)揮著重要作用。WEINSTEIN 等[6]、COLLINS等[7]報(bào)道，McCune-Albright綜合征患者的GNAS基因第8外顯子產(chǎn)生了Arg201錯(cuò)義突變，造成皮膚黑色素增多，出現(xiàn)咖啡樣色素斑。王歡歡等[4]對(duì)3個(gè)雞種進(jìn)行了GNAS基因突變檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)c.36-2277T＞C突變類型與膚色密切相關(guān)，CC基因型膚色黑，TT基因型膚色白。而在本次檢測(cè)樣本中，烏骨雞（烏膚）均為c.36-2277T＞C突變CC型，蘆花雞（白膚）均為TT型，這一結(jié)果與前述研究相符。

圖3 螢光素酶活性檢測(cè)結(jié)果Fig.3 Detection results of luciferase activity

本研究發(fā)現(xiàn)：c.36-2277T＞C突變點(diǎn)上下游993 bp片段能夠顯著增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄活性，根據(jù)片段所處位置（GNAS基因第2內(nèi)含子區(qū)），推測(cè)該片段屬于順式調(diào)控元件，具有增強(qiáng)子樣作用。同時(shí)，因?yàn)橥蛔凕c(diǎn)CC基因型的活性增強(qiáng)作用極顯著高于TT基因型，說明該位點(diǎn)的堿基類型會(huì)對(duì)基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控進(jìn)程產(chǎn)生重要影響。關(guān)于在轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)上的增強(qiáng)子突變的研究報(bào)道較多，例如：Gpr15基因增強(qiáng)子區(qū)的GATA-3轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)存在不同物種間的特異性突變，導(dǎo)致Gpr15基因在小鼠的TH2細(xì)胞中不表達(dá)[8]；在人SNCA基因第4內(nèi)含子的增強(qiáng)子區(qū)域中，EMX2/NKX6-1轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)存在1處A→G突變，與人類的帕金森病密切相關(guān)[9]。但是我們分析發(fā)現(xiàn)，GNAS基因的c.36-2277T＞C突變并不在轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)上，因此推測(cè)該突變點(diǎn)更可能是通過與上下游轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)共同作用來調(diào)控轉(zhuǎn)錄水平。

圖4 突變點(diǎn)上下游993 bp堿基序列及轉(zhuǎn)錄因子Fig.4 993 bp upstream and downstream sequences of the mutation and the transcript factors on the sequence

在此993 bp片段包含的結(jié)合位點(diǎn)中，轉(zhuǎn)錄因子TGGCA結(jié)合蛋白、C/EBP-alpha等已經(jīng)報(bào)道與病毒和細(xì)胞轉(zhuǎn)錄調(diào)控有關(guān)[10-11]。并且值得注意的是，緊鄰c.36-2277T＞C突變點(diǎn)的上下游分別為AP-1和ER-alpha/T3R-alpha結(jié)合位點(diǎn)。已有研究表明，AP-1常常與鄰近的細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子協(xié)同選擇增強(qiáng)子以驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄，例如：AP-1和NFATp/c一起結(jié)合到相鄰位點(diǎn)，才能使人GM-CSF基因的上游增強(qiáng)子發(fā)揮功能[12]；AP-1和CREB/ATF共同作用，可以激活I(lǐng)L-2Rɑ基因的CD28應(yīng)答增強(qiáng)子[13]；增強(qiáng)子元件上AP-1和ER通過互作，影響了雌激素誘導(dǎo)c-myc基因的表達(dá)[14]，等等。所以有理由認(rèn)為，GNAS基因c.36-2277T＞C突變及其相鄰結(jié)合位點(diǎn)是轉(zhuǎn)錄調(diào)控的核心元件，后續(xù)將進(jìn)一步試驗(yàn)求證。