陳艷花，蔣濤，王雪珍，錢平，唐順明，沈興家

（1.江蘇科技大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院，江蘇省蠶桑生物學(xué)與生物技術(shù)重點實驗室，江蘇 鎮(zhèn)江 212018；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部蠶桑遺傳改良重點實驗室，江蘇 鎮(zhèn)江 212018）

微RNA（microRNA,miRNA）是一類內(nèi)源性功能小RNA，在動物中廣泛參與細(xì)胞分化、形態(tài)發(fā)育、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、肌肉發(fā)育和維持細(xì)胞存活等方面的調(diào)控[1-3]，主要在轉(zhuǎn)錄后水平通過降解靶基因信使RNA（messenger RNA,mRNA）、抑制翻譯等作用機(jī)制調(diào)控基因表達(dá)[4-5]。miRNA主要通過相對保守的第2—8位堿基（種子序列）與靶基因完全或不完全結(jié)合發(fā)揮調(diào)控作用[6]。這種匹配調(diào)控擴(kuò)大了miRNA對靶基因調(diào)控的可能性，出現(xiàn)了單個miRNA調(diào)節(jié)一組mRNA和多個miRNA調(diào)節(jié)單個mRNA的現(xiàn)象。在蠶絲蛋白表達(dá)過程中，miR-965和miR-1926均能結(jié)合絲素輕鏈基因BmFib-L的3′非翻譯區(qū)（3′untranslated region,3′UTR），抑制靶基因的表達(dá)[7]；let-7在人體內(nèi)通過結(jié)合不同靶基因，參與肺癌和乳腺癌的調(diào)控[1,8]。研究表明，miRNA并不是單一結(jié)合靶基因的3′UTR，還可能結(jié)合5′UTR及蛋白質(zhì)編碼區(qū)（coding sequence,CDS），從而實現(xiàn)抑制或促進(jìn)表達(dá)調(diào)控的功能[9-11]。

家蠶（Bombyx mori）是世界上重要的經(jīng)濟(jì)性昆蟲，也是鱗翅目中具有中國特色的重要的模式生物。絲腺是蠶絲蛋白合成的特異性組織，且具有在5齡后期表達(dá)的時間特異性。蠶絲蛋白高效的合成特性引起了許多研究者的興趣并在分子水平上對蠶絲蛋白的合成機(jī)制進(jìn)行了深入的研究。蠶絲蛋白由絲素和絲膠組成，通過共價鍵或非共價鍵形成緊密的結(jié)構(gòu)。研究表明，蠶絲蛋白表達(dá)系統(tǒng)是一個復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，除了通用轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控外，還有絲腺組織特異的反式作用因子。轉(zhuǎn)錄因子SGF-1在中部絲腺參與Ser-1基因的表達(dá)[12]；蛋白因子BMFA既能與絲素輕鏈基因BmFib-L結(jié)合，還能負(fù)調(diào)控P25基因[13]。miRNAs、絲腺轉(zhuǎn)錄因子和蠶絲蛋白之間存在調(diào)控關(guān)系，如bmo-miR-2755*不但能下調(diào)BmFib-L基因的表達(dá)，還能促進(jìn)P25基因的表達(dá)[14]；bmo-miR-2758能抑制絲腺特異轉(zhuǎn)錄因子FMBP-1的表達(dá)[15]。

由于現(xiàn)有的研究仍無法解釋蠶絲蛋白精密合成的調(diào)控機(jī)制，所以基于miRNA揭示蠶絲蛋白表達(dá)機(jī)制仍有待進(jìn)行更深入的研究。本實驗室SONG等[16]前期對家蠶4、5齡幼蟲后部絲腺小RNA進(jìn)行了高通量測序，獲得了35個新的可能參與蠶絲蛋白調(diào)控的miRNAs。本研究通過RNAhybrid軟件預(yù)測其中可能對BmFib-L表達(dá)具有調(diào)節(jié)作用的miRNAs，獲得了1個候選bmo-miR-0031-3p（曾稱為miR-0031*，以下簡稱“miR-0031-3p”），分別構(gòu)建miR-0031-3p表達(dá)載體pcDNA3.0[ie1-egfp-pre-miR-0031-3p-SV40]和BmFib-L3′UTR 重組質(zhì)粒pGL3.0[A3-luc-Fib-L-3′UTR-SV40]，以及人工合成miR-0031-3p的模擬物（mimic）和抑制物（inhibitor），然后分別在BmN細(xì)胞和5齡第2天幼蟲中驗證miR-0031-3p對BmFib-L表達(dá)的調(diào)控作用，證實了miR-0031-3p在細(xì)胞和個體水平上能夠下調(diào)BmFib-L的表達(dá)。該研究結(jié)果對闡明家蠶miRNA功能和蠶絲蛋白表達(dá)調(diào)控的分子機(jī)制具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

家蠶品系P50，由農(nóng)業(yè)農(nóng)村部蠶桑遺傳改良重點實驗室（江蘇省蠶桑生物學(xué)與生物技術(shù)重點實驗室）保存，解除滯育的越年蠶卵或浸酸后的蠶卵于25℃條件下催青，孵化后用常規(guī)新鮮桑葉飼養(yǎng)。

家蠶卵巢培養(yǎng)細(xì)胞BmN、絲素輕鏈基因BmFib-L3′UTR表達(dá)載體pGL3.0[A3-luc-SV40]、miRNA表達(dá)載體pcDNA3.0[ie1-egfp-SV40]和包含海腎螢光素酶報告基因的質(zhì)粒pRL-CMV均由農(nóng)業(yè)農(nóng)村部蠶桑遺傳改良重點實驗室保存或構(gòu)建。質(zhì)粒DNA、RNA提取試劑盒，反轉(zhuǎn)錄試劑盒，ExTaq酶，連接載體pMD19-T均購自日本TaKaRa公司。引物合成與DNA測序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。miR-0031-3p的模擬物和抑制物由廣州市銳博生物公司合成。轉(zhuǎn)染試劑EntransterTMH4000購自北京英格恩生物科技有限公司，螢光素酶檢測試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司，TC-100細(xì)胞培養(yǎng)基購自德國Applichem公司，胎牛血清購自美國Corning公司，熒光定量試劑盒（SYBR Green PCR kit）為德國Qiagen公司產(chǎn)品。

螢光素酶檢測儀（20/20 luminometer）由美國Promega公司生產(chǎn)，DP80型熒光顯微鏡由日本Olympus公司生產(chǎn)。熒光定量PCR儀（LightCycler?96 RT-PCR system）為美國Roche公司產(chǎn)品。

1.2 調(diào)控BmFib-L表達(dá)的候選miRNA的生物信息學(xué)預(yù)測

從NCBI數(shù)據(jù)庫中獲取BmFib-L3′UTR序列（登錄號NM_001044023）和SONG等[16]對5齡第3天家蠶幼蟲絲腺組織測序獲得的家蠶miRNAs，通過在線靶基因預(yù)測工具RNAhybrid（https://bibiserv2.cebitec.uni-bielefeld.de/rnahybrid），根據(jù)5′端種子序列第2—8位堿基的配對水平和折疊自由能（＜－83.7 kJ/mol），篩選出1個對BmFib-L具有潛在調(diào)控作用的候選家蠶miRNA——bmo-miR-0031-3p（簡稱“miR-0031-3p”），進(jìn)行后續(xù)的驗證實驗。

1.3 候選miRNA表達(dá)特征的半定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測分析

解剖家蠶5齡第3天幼蟲，獲取頭、表皮、中腸、馬氏管、氣管、脂肪體、前部絲腺、中部絲腺、后部絲腺、血淋巴細(xì)胞、精巢及卵巢共12個組織，分別提取相應(yīng)組織的總RNA，于－80℃條件下冷藏，備用。

根據(jù)miRNA的特性，設(shè)計miR-0031-3p特異的反轉(zhuǎn)錄引物、上游引物及通用的下游引物（表1）。以后部絲腺的總RNA為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得第一條鏈cDNA；以此cDNA為模板進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction,PCR），得到的PCR產(chǎn)物用4%瓊脂糖凝膠電泳檢測，切膠回收長度在50～100 bp區(qū)間的片段。將目的片段與載體pMD19-T連接，送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序驗證。

序列驗證正確后，將全部12個組織的總RNAs按照上述方法進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR）擴(kuò)增，以BmU6為內(nèi)參基因，得到的產(chǎn)物用4%瓊脂糖凝膠電泳檢測，采用Gel-ProAnalyzer凝膠成像軟件分析候選miR-0031-3p在不同組織中的相對表達(dá)量。

1.4 miR-0031-3p和BmFib-L 3′UTR重組表達(dá)載體的構(gòu)建

在NCBI數(shù)據(jù)庫中獲取miR-0031-3p的前體序列pre-miR-0031-3p，并在該片段上下游各延伸近80 bp作為擴(kuò)增的目的片段，采用NCBI Primer BLAST設(shè)計上下游引物（表1），進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回收產(chǎn)物并與載體pMD19-T連接，然后轉(zhuǎn)化大腸埃希菌感受態(tài)細(xì)胞，涂布并挑取單菌落培養(yǎng)，送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序驗證。將測序正確的重組pMD19-T載體在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h，按照試劑盒說明書提取質(zhì)粒。用限制性內(nèi)切酶HindⅢ和BamHⅠ對pre-miR-0031-3p載體質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，回收目的片段，再與經(jīng)相同雙酶切（HindⅢ/BamHⅠ）的質(zhì)粒 pcDNA3.0[ie1-egfp-SV40]連接，構(gòu)建候選miR-0031-3p的重組表達(dá)載體pcDNA3.0[ie1-egfp-pre-miR-0031-3p-SV40]，對表達(dá)載體再進(jìn)行雙酶切鑒定，將酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒于－20℃條件下保存，備用。

靶基因BmFib-L3′UTR重組表達(dá)載體pGL3.0[A3-luc-Fib-L-3′UTR-SV40]的構(gòu)建步驟同上，引物見表1，限制性內(nèi)切酶為XbaⅠ和FseⅠ。

1.5 miR-0031-3p調(diào)控BmFib-L表達(dá)的細(xì)胞水平驗證

為了驗證miR-0031-3p對BmFib-L表達(dá)的調(diào)控作用，首先在卵巢來源的BmN細(xì)胞中進(jìn)行實驗。處理組：共轉(zhuǎn)染pcDNA3.0[ie1-egfp-pre-miR-0031-3p-SV40]+pGL3.0[A3-luc-Fib-L-3′UTRSV40]+pRL-CMV；陽性對照組：共轉(zhuǎn)染pcDNA3.0[ie1-egfp-SV40]+pGL3.0[A3-luc-Fib-L-3′UTRSV40]+pRL-CMV。轉(zhuǎn)染液中3種質(zhì)粒以4∶4∶2比例混合，每孔細(xì)胞共轉(zhuǎn)染1.6 μg質(zhì)粒DNAs，按照轉(zhuǎn)染試劑EntransterTM-H4000的說明書操作。

表1 相關(guān)基因引物序列Table 1 Primer sequences for related genes

為了進(jìn)一步驗證miR-0031-3p對靶基因表達(dá)的影響，人工合成miR-0031-3p的模擬物（mimic）和抑制物（inhibitor）。設(shè)置2個實驗處理組：共轉(zhuǎn)染mimic+pGL3.0[A3-luc-Fib-L-3′UTR-SV40]+pRLCMV，共轉(zhuǎn)染inhibitor+pcDNA3.0[ie1-egfp-premiR-0031-3p-SV40]+pGL3.0[A3-luc-Fib-L-3′UTRSV40]+pRL-CMV。同樣以轉(zhuǎn)染陽性對照組質(zhì)粒的細(xì)胞為對照，進(jìn)行3次獨立實驗，每次設(shè)置3個重復(fù)。

轉(zhuǎn)染48 h后，在熒光顯微鏡下觀察含增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescent protein,EGFP）的細(xì)胞，評估其轉(zhuǎn)染效率；收集細(xì)胞，按照試劑盒說明書進(jìn)行裂解處理，用雙螢光素酶報告試劑盒在螢光素酶檢測儀（20/20 luminometer）上檢測上清液中螢光素酶活性，以螢火蟲螢光素酶活性值與海腎螢光素酶活性值的比值作為報告基因的相對活性，以此衡量miR-0031-3pz在體外對BmFib-L表達(dá)的調(diào)控作用。

1.6 miR-0031-3p調(diào)控BmFib-L表達(dá)的個體水平驗證

為了驗證miR-0031-3p在家蠶體內(nèi)對BmFib-L表達(dá)的調(diào)控作用，分析了在miR-0031-3p過表達(dá)和抑制狀態(tài)下BmFib-L表達(dá)的變化。用轉(zhuǎn)染試劑分別孵育pcDNA3.0[ie1-egfp-SV40]、pcDNA3.0[ie1-egfp-pre-miR-0031-3p-SV40]和模擬物（mimic），并注射到5齡第2天的幼蟲體腔內(nèi)，然后用新鮮桑葉在25℃條件下飼養(yǎng)該幼蟲，36 h后解剖蠶體，獲取后部絲腺，以2條家蠶的絲腺組織為一組提取總RNA，對靶基因BmFib-L的表達(dá)進(jìn)行定量分析。方法同上，用轉(zhuǎn)染試劑孵育抑制物（inhibitor），在5齡第2天的幼蟲體腔內(nèi)注射抑制內(nèi)源性miR-0031-3p，分析BmFib-L表達(dá)的變化，以注射pcDNA3.0[ie1-egfp-SV40]的幼蟲為陽性對照。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

用SPSS 19.0軟件分析不同處理組之間的差異顯著性，數(shù)據(jù)結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。用DNAstar軟件對基因序列進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 對靶基因BmFib-L表達(dá)具有潛在調(diào)控作用的miRNA預(yù)測結(jié)果

在NCBI數(shù)據(jù)庫中下載BmFib-L3′UTR序列和SONG等[16]測序獲得的miRNAs，利用軟件RNA-hybrid預(yù)測兩者的結(jié)合位點，篩選出了miRNA的種子序列能與靶位點完全匹配的miR-0031-3p（圖1），其最小自由能為－96.3 kJ/mol，后文將研究其對BmFib-L基因表達(dá)的調(diào)控作用。

2.2 候選miRNA表達(dá)譜特征的半定量RT-PCR檢測分析結(jié)果

以5齡第3天幼蟲后部絲腺總RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄后合成第一條鏈cDNA；再以此cDNA為模板，以miR-0031-3p成熟體的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到的產(chǎn)物片段大小約80 bp，測序結(jié)果與SONG等[16測序獲得的序列一致，說明引物設(shè)計正確，可用于后續(xù)實驗。

圖1 miR-0031-3p對BmFib-L mRNA 3′UTR潛在結(jié)合位點的生物信息學(xué)預(yù)測Fig.1 Prediction of potential binding site of miR-0031-3p at BmFib-L mRNA3′UTR

對5齡幼蟲各組織的總RNA的半定量RT-PCR分析結(jié)果顯示，miR-0031-3p不但在其他組織中有表達(dá)，而且在后部絲腺中也具有一定的表達(dá)量（圖2）。據(jù)此推測，miR-0031-3p對在后部絲腺高量表達(dá)的靶基因BmFib-L的表達(dá)存在空間調(diào)控的可能性。

2.3 miR-0031-3p和BmFib-L 3′UTR表達(dá)載體的構(gòu)建結(jié)果

用特異性引物擴(kuò)增大小為241 bp的前體序列pre-miR-0031-3p和大小為342 bp的BmFib-L3′UTR序列，經(jīng)測序驗證，序列正確。構(gòu)建在BmNPV ie1啟動子調(diào)控下的pre-miR-0031-3p的表達(dá)載體pcDNA3.0[ie1-egfp-pre-miR-0031-3p-SV40]和在BmA3啟動子控制下與螢光素酶基因融合的BmFib-L3′UTR重組載體pGL3.0[A3-luc-Fib-L-3′UTR-SV40]（圖3A），經(jīng)酶切鑒定正確（圖3B），可用于后續(xù)實驗。

圖2 半定量RT-PCR檢測miR-0031-3p在不同組織中的表達(dá)Fig.2 Expression profiling of miR-0031-3p by semiquantitative RT-PCR

圖3 Pre-miR-0031-3p和BmFib-L 3′UTR表達(dá)載體的構(gòu)建Fig.3 Construction of pre-miR-0031-3p and BmFib-L 3′UTR

2.4 miR-0031-3p在BmN細(xì)胞中對BmFib-L表達(dá)的抑制

將構(gòu)建好的載體分別在處理組（含miR-0031-3p表達(dá)載體）和對照組（不含miR-0031-3p表達(dá)載體）中共轉(zhuǎn)染BmN細(xì)胞，48 h后利用熒光顯微鏡觀察。結(jié)果（圖4A）顯示，多數(shù)細(xì)胞呈現(xiàn)綠色熒光，表明載體轉(zhuǎn)染效率較高。螢光素酶活性檢測結(jié)果表明，處理組的螢光素酶活性與陽性對照組相比顯著下降（圖4B）。

用模擬物（mimic）和抑制物（inhibitor）分別轉(zhuǎn)染BmN細(xì)胞，48 h后收集細(xì)胞，檢測螢光素酶活性。結(jié)果顯示，與對照組相比，模擬物轉(zhuǎn)染組的螢光素酶表達(dá)量極顯著降低，抑制物轉(zhuǎn)染組的螢光素酶表達(dá)量極顯著上升（圖4C）。說明miR-0031-3p在細(xì)胞水平可顯著抑制BmFib-L基因的表達(dá)，也表明合成的模擬物和抑制物具有生物活性，可用于后續(xù)體內(nèi)實驗。

2.5 家蠶體內(nèi)miR-0031-3p對BmFib--L表達(dá)的抑制

在家蠶體內(nèi)過表達(dá)miR-0031-3p，36 h后，BmFib-L的表達(dá)量相較于陽性對照顯著下降；而注射抑制物（inhibitor）的個體中BmFib-L的表達(dá)量顯著高于陽性對照組（圖5）。證明miR-0031-3p在體內(nèi)對靶基因BmFib-L的表達(dá)具有抑制作用。

3 討論

基于生物信息學(xué)軟件的miRNAs預(yù)測，是研究miRNAs對靶標(biāo)基因調(diào)控功能的第一步，且隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展和對miRNAs認(rèn)知的深入，更多的miRNAs獨特的性質(zhì)或者結(jié)構(gòu)特征被編入生物信息學(xué)軟件的程序中，但是這些軟件無法做到完全精準(zhǔn)地篩選，仍需要大量的相關(guān)驗證實驗來佐證。本實驗從前期分析中獲得對絲素蛋白基因表達(dá)具有潛在調(diào)控作用的家蠶miRNAs[16]，獲得了1個候選miR-0031-3p，生物信息學(xué)預(yù)測表明，miR-0031-3p在BmFib-L3′UTR有結(jié)合位點，且分別在細(xì)胞水平和個體水平上證實miR-0031-3p對BmFib-L表達(dá)有抑制作用。

圖4 miR-0031-3p在BmN細(xì)胞中對BmFib-L的表達(dá)調(diào)控Fig.4 BmFib-L expression regulated by miR-0031-3p inBmN cells

家蠶5齡幼蟲，特別是處于第3—5天盛食期的5齡幼蟲，體內(nèi)蠶絲蛋白大量合成，這與各種水平的協(xié)同調(diào)控密不可分。家蠶蠶絲蛋白基因表達(dá)系統(tǒng)是一個復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，不僅有轉(zhuǎn)錄因子（transcription factor,TF）的協(xié)同參與，還有家蠶miRNAs的參與[17]。轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控，主要是由于反式作用因子與順式作用元件結(jié)合，正調(diào)控或負(fù)調(diào)控蠶絲蛋白基因的表達(dá)[18]。而大量研究表明，bmo-miRNAs在轉(zhuǎn)錄后水平對蠶絲蛋白基因的表達(dá)起著抑制作用[7,14]。家蠶絲素由BmFib-L、BmFib-H和P25這3個基因的表達(dá)產(chǎn)物按照6∶6∶1的比例組成，如何維持這種特定的比例，以及在這些基因的表達(dá)過程中，miRNAs在轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控是否對其具有某種影響，尚不得而知。

圖5 在體內(nèi)過表達(dá)和抑制表達(dá)miR-0031-3p后BmFib-L的表達(dá)檢測Fig.5 BmFib-L expressionin vivo under the conditions of miR-0031-3p overexpression and inner miR-0031-3p inhibition

正是由于多種基因在不同水平上的相互作用，才使得對基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的研究更加復(fù)雜。對miRNAs和轉(zhuǎn)錄因子協(xié)同調(diào)控靶基因機(jī)制的研究表明，兩者之間可以形成多種多樣復(fù)雜的調(diào)控回路。對哺乳動物和酵母的基因組研究發(fā)現(xiàn)，miRNA和TF能協(xié)同調(diào)控共有的靶基因，在miR-TF共調(diào)節(jié)的網(wǎng)絡(luò)中，TF可以調(diào)節(jié)miRNA，或受miRNA調(diào)節(jié)，形成多樣性的前饋環(huán)路（feed forward loop,FFL）[19]。miRNA和TF除了前饋環(huán)路，還有復(fù)雜的反饋調(diào)節(jié)，如PITX3特異性地誘導(dǎo)miR-133b的轉(zhuǎn)錄，而其自身活性在轉(zhuǎn)錄后通過FFL被miR-133b下調(diào)[20]?？傊?，由于絲腺細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子和眾多miRNAs對蠶絲蛋白基因表達(dá)的協(xié)同和拮抗調(diào)控，才使得蠶絲蛋白最終能夠高效地合成。但是，要清楚地闡明蠶絲蛋白表達(dá)調(diào)控的分子機(jī)制，還需要更多更深入的研究。