曹麗雯，支肖，戴嘉禾，于寧寧，陳怡倩，葉立新，陳利萍*，徐禮根*

（1.浙江大學農(nóng)業(yè)與生物技術學院園藝系，杭州 310058；2.浙江鳳陽山-百山祖國家級自然保護區(qū)鳳陽山管理處，浙江 麗水 323700）

蛛網(wǎng)萼（Platycrater arguta）屬于繡球花科（Hydrangeaceae）蛛網(wǎng)萼屬（Platycrater）小型落葉灌木[1]，喜生于溪澗邊和陰濕裸巖旁[2]。其植株常呈叢生狀態(tài)，花瓣4枚，花色純白，具有極高的觀賞價值。同時，蛛網(wǎng)萼作為東亞特有的單種屬植物，對研究東亞植物地理、植物區(qū)具有深遠的科學價值[3-4]。近年來，由于生物學特性和環(huán)境因素的雙重影響，蛛網(wǎng)萼分布面積和資源量日漸減少，種群自然增強能力減弱，面臨很高的滅絕風險。因此，1992年蛛網(wǎng)萼被列入《中國植物紅皮書——稀有瀕危植物》名錄，為國家二級瀕危種[5]。蛛網(wǎng)萼在自然條件下主要通過產(chǎn)生大量種子進行繁育[6]。然而，已有研究表明，盡管蛛網(wǎng)萼能產(chǎn)生較多的種子，但由于種子體積小限制了其獲取養(yǎng)分，使得真正成熟能萌發(fā)的種子數(shù)量十分有限，而且在野外環(huán)境條件下落地的種子隨著時間的延長，其活力不斷下降，導致蛛網(wǎng)萼種子在自然狀態(tài)下萌發(fā)率極低[7]。張麗芳等[6]研究表明，即使蛛網(wǎng)萼成熟種子在適宜的環(huán)境條件下，也存在萌發(fā)時間長，萌發(fā)不整齊，萌發(fā)的幼苗脆弱、不易生長等問題。這些因素都導致了蛛網(wǎng)萼資源量減少和種群自然增強困難。植物組織培養(yǎng)是提高種子萌發(fā)率、加快植物繁育的重要的現(xiàn)代生物技術之一[8]。然而，迄今為止通過組織培養(yǎng)培育蛛網(wǎng)萼的研究尚未見報道。

近年來，野生植物的開發(fā)利用已經(jīng)成為園林植物與觀賞園藝研究方向的重要組成部分，是豐富園林植物物種多樣性的根基與源泉。然而，野生蛛網(wǎng)萼存在生長緩慢、植株矮小、對生長環(huán)境要求高等問題，限制了對其進一步的開發(fā)利用。研究表明，野生植株多倍體的誘導是對其開發(fā)利用的有效途徑之一。多倍體植株一般具有生長旺盛，抗逆、抗病性強和適應能力廣等特性[9]。而利用秋水仙素進行化學誘變是獲得多倍體植株的重要方法之一[10-11]。例如，CHEN等用秋水仙素對野生剪秋羅進行加倍處理后，獲得了大花、矮壯、觀賞價值更高的植株[12]。

本研究以采集于浙江鳳陽山-百山祖國家級自然保護區(qū)的蛛網(wǎng)萼種子為試驗材料，通過未成熟種子的離體培養(yǎng)，獲得試管實生苗。以試管實生苗的莖段為外植體，培養(yǎng)在木本植物用培養(yǎng)基（woody plant medium,WPM）[13]附加不同6-芐氨基嘌呤（6-benzylaminopurine,6-BA）和α-萘乙酸（1-naphthylacetic acid,NAA）質量濃度配比的培養(yǎng)基上，建立蛛網(wǎng)萼的“芽生芽”離體繁殖體系。在此基礎上，通過不同質量濃度秋水仙素處理帶腋芽的莖段，誘導蛛網(wǎng)萼多倍體材料的獲得。再生芽經(jīng)生根、煉苗后野外回歸至自然保護區(qū)內生長。研究結果對蛛網(wǎng)萼瀕危資源的保護及其利用具有重要的理論意義和實踐價值。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

分別采集野生蛛網(wǎng)萼成熟果實和未成熟果實。成熟果實為紫紅色，頂部孔呈開裂狀態(tài)；未成熟果實為淺綠色，頂部孔呈閉合狀態(tài)。采樣時間為2013年9月中下旬到10月初。地點為浙江鳳陽山-百山祖國家級自然保護區(qū)內。

1.2 試驗方法

1.2.1 材料消毒

分別將摘取的成熟果實和未成熟果實用洗潔精清洗后在流動水下沖洗2 h。將沖洗好的果實放置在超凈工作臺上，用75%乙醇浸泡30 s，無菌水洗3次。再用0.1%HgCl2消毒10 min，其間搖晃3～5次后，無菌水沖洗5次。最后用無菌濾紙將果實上的多余水分吸干。

1.2.2 種子的剝離與接種

將消毒后的果實置于鋪有滅菌濾紙的培養(yǎng)皿中，用滅菌解剖刀切除上下兩端各0.3 cm左右。然后縱向切開，左手持鑷子夾住果實外皮，右手持解剖刀將種子及部分子房組織取下。以底部鋪1層濕潤濾紙的培養(yǎng)皿作發(fā)芽床，以置于發(fā)芽床的成熟種子作對照（CK）。將成熟種子和未成熟種子連同部分子房組織接種到種子萌發(fā)培養(yǎng)基（表1）上進行培養(yǎng)，直至未成熟種子顏色變?yōu)榘岛稚匐S機挑取成熟種子和未成熟種子各10顆轉移至新的種子萌發(fā)培養(yǎng)基上。培養(yǎng)條件為：（20±2）℃、黑暗。

表1 培養(yǎng)基成分Table 1 Component of medium

1.2.3 種子的萌發(fā)

將以上種子轉移至弱光條件（光照強度20 μmol/(m2·s)、光照時間12 h/d）下誘導萌發(fā)。培養(yǎng)35 d后統(tǒng)計萌發(fā)率，并觀察試管實生苗的生長情況。

1.2.4 繁殖體系的建立

將試管實生苗轉移至WPM+1mg/L6-BA+1mg/L玉米素+500 mg/L水解酪蛋白培養(yǎng)基上生長，待其長出3～4片葉后，取單節(jié)的試管實生苗莖段（約0.5 cm左右），轉移至1～4號含4種不同6-BA和NAA質量濃度配比的繁育培養(yǎng)基（表1）上。每個濃度處理4個莖段外植體，每隔10 d觀察并記錄誘導的再生芽的高度和生長情況。培養(yǎng)條件為：溫度（20±2）℃、光照強度 20 μmol/(m2·s)、光照時間 12 h/d。平均生長高度變化率=（平均終株高－平均起始株高）/平均起始株高×100%。

1.2.5 多倍體誘導試驗

取蛛網(wǎng)萼帶腋芽的莖段分別置于含100、200、300、500 mg/L 4種質量濃度的秋水仙素的液體MS培養(yǎng)基中，于搖床內（150 r/min，28℃）培養(yǎng)3 d。再將經(jīng)秋水仙素液體培養(yǎng)基處理過的帶腋芽莖段移植于WPM培養(yǎng)基上，觀察其生長情況。培養(yǎng)條件為：溫度（20±2）℃、光照強度20 μmol/(m2·s)、光照時間12 h/d。每個濃度處理3個莖段，并進行3次生物學重復。在多倍體誘導試驗中，存活率=（成活個數(shù)/接種個數(shù)）×100%。

1.2.6 流式細胞分析

稱取單個誘導芽完全展開的葉片約20 mg，放入塑料培養(yǎng)皿中，加入100 μL OttoⅠ緩沖液，用鋒利的刀片將其剁碎，以釋放細胞核。再用直徑為30 μm的尼龍網(wǎng)過濾到1.5 mL離心管中，5 000 r/min離心2 min。取沉淀及100 μL上清液，吹打混勻。再加入100 μL OttoⅠ緩沖液，室溫靜置5 min，其間將溶液顛倒2～3次。加入500 μL OttoⅡ緩沖液和200 μL PI（碘化丙啶+核糖核酸酶）染色液，輕輕搖動混勻，避光靜置5 min后，用BD FACS Calibur流式細胞儀測定數(shù)據(jù)，并通過Mod Fit LT軟件進行分析[11]。

1.2.7 生根煉苗及野外回歸

待再生芽長到1 cm左右后，轉移至WPM+0.5 mg/L IBA生根培養(yǎng)基（表1）中誘導生根并觀察生根情況。培養(yǎng)條件為：溫度（20±2）℃、光照強度20 μmol/(m2·s)、光照時間12 h/d。

選取根系長為1.0～2.5 cm的試管苗，將瓶口打開，在自然環(huán)境中煉苗2～3 d。再將試管苗取出，用清水沖洗除去殘留的培養(yǎng)基后轉移至消毒的基質中。為保持蛛網(wǎng)萼生長環(huán)境高濕，每12 h或1 d對其全株進行噴淋，并避免陽光直射[12]。煉苗結束后選取部分植株進行野外回歸。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 22.0統(tǒng)計分析軟件包對數(shù)據(jù)進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 種子的萌發(fā)情況

自然條件下種子萌發(fā)率低是野生植物發(fā)生瀕危的重要原因之一。本試驗以置于發(fā)芽床（CK）的成熟種子為對照，開展了成熟種子和未成熟種子在培養(yǎng)基上的誘導萌發(fā)試驗。結果（表2）發(fā)現(xiàn)，播種35 d后，成熟種子無論在發(fā)芽床還是在種子萌發(fā)培養(yǎng)基上均不發(fā)芽，萌發(fā)率為0。未成熟種子在種子萌發(fā)培養(yǎng)基上顏色由淺黃褐色（圖1A）逐漸轉變?yōu)樯詈稚?，培養(yǎng)成熟后種子萌發(fā)率達到了40.00%。萌發(fā)的試管實生苗葉片翠綠，外形矮?。▓D1B），生長速度較慢。

表2 不同處理方法對蛛網(wǎng)萼種子萌發(fā)率的影響Table 2 Effect of different treatments on germination rate ofP.arguta

圖1 蛛網(wǎng)萼未成熟種子離體培養(yǎng)Fig.1 In vitro culture of immature seeds of P.arguta

2.2 繁殖體系的建立情況

為了擴大試管實生苗的數(shù)量，本試驗將帶有單個節(jié)的莖段（圖2A）置于1～4號繁育培養(yǎng)基（表1）上進行培養(yǎng)。20 d左右發(fā)現(xiàn)，不同質量濃度6-BA和NAA的組合對誘導芽的個數(shù)影響沒有差異，都只誘導產(chǎn)生了單個腋芽，并沒有誘導出叢生芽。然而，1號培養(yǎng)基中誘導再生芽的平均生長高度變化率最大，為61.54%，是其他質量濃度配方的1.7～2.5倍，且腋芽長勢良好，顏色濃綠，葉片較大（圖2B）。6-BA和NAA不同質量濃度的組合誘導的再生芽的平均生長高度變化率存在顯著差異（表3）。由此可見，WPM+1 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA培養(yǎng)基是蛛網(wǎng)萼莖段培養(yǎng)的最佳配方。

圖2 蛛網(wǎng)萼擴繁體系的建立Fig.2 In vitro propagation of P.arguta

2.3 蛛網(wǎng)萼的多倍體誘導結果

對瀕危植物多倍體的誘導一方面可以提高其對環(huán)境的適應能力，另一方面還可以豐富其遺傳多樣性。本研究結果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過多倍體誘導處理的帶腋芽的莖段存活率隨秋水仙素質量濃度的增加而顯著降低，當秋水仙素質量濃度增加至500 mg/L時，帶芽莖段全部死亡（表4）。存活下來的誘導芽經(jīng)流式細胞儀鑒定發(fā)現(xiàn)：用100 mg/L秋水仙素處理后共獲得了2個混倍體的芽，為二倍體和四倍體混合；用200 mg/L秋水仙素處理后共獲得了5個混倍體的芽，為二倍體和四倍體混合（表5和圖3）。綜上表明：本試驗獲得了蛛網(wǎng)萼混合倍體的芽，而且二倍體的細胞數(shù)較多，但是其多倍體誘導的最佳質量濃度還需要進一步探究。

2.4 生根煉苗與野外回歸分析

野外回歸是野生植物種群增強與重建的重要途徑，能更有效地對瀕危植物進行拯救和保護。本試驗對獲得的再生芽進行生根誘導，將生長至1 cm高度左右的蛛網(wǎng)萼試管苗于WPM+0.5mg/L IBA生根培養(yǎng)基上進行誘導，產(chǎn)生了4～6根、1～2 cm長的根，并帶有許多白色根毛（圖4A）。經(jīng)過7 d左右的煉苗處理后移栽至基質上進行培養(yǎng)，蛛網(wǎng)萼試管苗生長狀態(tài)良好，葉片肥大，顏色翠綠（圖4B）。選取部分移栽苗于2017年4月野外回歸至浙江鳳陽山-百山祖國家級自然保護區(qū)中。

表3 不同植物生長調節(jié)劑濃度處理對蛛網(wǎng)萼生長的影響Table 3 Effect of different concentrations of plant growth regulator on P.arguta growth

表4 不同質量濃度的秋水仙素對蛛網(wǎng)萼存活率的影響Table 4 Effect of different concentrations of colchicine onsurvival rate of P.arguta

表5 不同質量濃度的秋水仙素誘導對蛛網(wǎng)萼混倍體芽個數(shù)的影響Table 5 Effect of different concentrations of colchicine onnumbers of induced buds of P.arguta mixoploids

3 討論

3.1 未成熟種子培養(yǎng)對提高蛛網(wǎng)萼種子萌發(fā)率的作用

野生植物主要依靠種子繁衍后代。然而本試驗發(fā)現(xiàn)，蛛網(wǎng)萼成熟種子無論在發(fā)芽床還是在WPM+400 mg/L谷氨酰胺+500 mg/L水解酪蛋白+2 000 mg/L活性炭種子萌發(fā)培養(yǎng)基上均不能萌發(fā)。張麗芳等也發(fā)現(xiàn)，蛛網(wǎng)萼成熟種子在自然條件下萌發(fā)困難，處理后的蛛網(wǎng)萼種子最高萌發(fā)率只有12.5%，仍很低[6]。對于成熟種子萌發(fā)率低的情況，可以對未成熟種子進行組織培養(yǎng)，提高其萌發(fā)率。丁蘭等發(fā)現(xiàn)，瀕危植物佛手參的成熟種子難以萌發(fā)，而未成熟種子經(jīng)培養(yǎng)后萌發(fā)率可達20%[14]。本試驗使蛛網(wǎng)萼未成熟種子在萌發(fā)培養(yǎng)基中培養(yǎng)35 d后萌發(fā)率達到40%，有效解決了蛛網(wǎng)萼種子活力低或無活力的問題，研究結果可以作為保護蛛網(wǎng)萼瀕危資源的重要手段之一。

3.2 蛛網(wǎng)萼高效離體繁殖體系的建立

野外觀察發(fā)現(xiàn)，蛛網(wǎng)萼在自然狀態(tài)下生長緩慢，植株矮小，且蛛網(wǎng)萼試管苗過于矮小，甚至葉片緊貼培養(yǎng)基，不利于其后期誘導生根。因此，本試驗將誘導芽的平均生長高度變化率作為建立繁殖體系的重要衡量指標。已有研究發(fā)現(xiàn)，不同激素濃度及其組合方式對誘導芽的生長具有顯著促進作用[15]。然而，至今仍未有對蛛網(wǎng)萼的研究。本試驗利用“芽生芽”的培養(yǎng)方式[16]，發(fā)現(xiàn)添加1 mg/L 6-BA和0.5 mg/L NAA的繁育培養(yǎng)基誘導的芽生長率最大，長勢良好。此配方不僅有利于后期生根誘導和野外回歸的開展，而且在一定程度上彌補了蛛網(wǎng)萼作為木本植物生長緩慢的缺陷，能在短時間內獲得長勢良好且基因組相同的蛛網(wǎng)萼試管苗，并防止通過愈傷組織途徑帶來的遺傳變異，有效規(guī)避了對稀有瀕危種質資源的破壞[17]。

圖3 不同質量濃度的秋水仙素處理后蛛網(wǎng)萼的流式細胞分析圖Fig.3 Flow cytometric analysis histograms of P.arguta under different concentrations of colchicine treatments

圖4 蛛網(wǎng)萼生根與移栽煉苗Fig.4 Root induction and seedling transplanted of P.arguta

3.3 秋水仙素誘導多倍體

CHEN等[12]發(fā)現(xiàn)，在組織培養(yǎng)的條件下利用秋水仙素處理莖段可以獲得多倍體植株。本試驗利用秋水仙素處理蛛網(wǎng)萼試管實生苗莖段，誘導出了二倍體和四倍體的混倍體再生芽，說明秋水仙素只誘導了再生芽部分細胞的加倍。混倍體在秋水仙素處理后非常常見[18]，ZAHEDI等對大葉青蘭進行誘導時，同時誘導出了四倍體和混倍體植株[19]，而吉仁花等用秋水仙素處理金達苜蓿的愈傷組織只獲得了混倍體[20]。一般情況下，可以通過提高秋水仙素的濃度來進一步誘導多倍體植株的產(chǎn)生，但是隨著秋水仙素濃度的增大，其對細胞的毒害作用也加大。在本試驗中，隨著秋水仙素質量濃度的升高，混倍體產(chǎn)生的比率增大，但是誘導芽死亡率也升高，這與SHI等對冬棗（Ziziphus jujubeMill.）的誘導結果一致[21]。本研究獲得的混倍體再生芽需要通過進一步誘導不定芽的產(chǎn)生來獲得四倍體的植株[22-24]。

綜上所述，本研究成果為相關稀有瀕危種利用未成熟種子離體培養(yǎng)誘導種子萌發(fā)和建立繁殖體系來改善植株生長速度和植株高度提供了技術支持，并對秋水仙素誘導加倍瀕危物種染色體以優(yōu)化種質資源、增加物種多樣性提供了技術參考。