唐小鐵，徐潔，王麗媛，于洋，崔學(xué)彬，孫維言

原發(fā)性腎小球疾病作為臨床常見疾病，是引起終末期腎臟疾病的重要原因。系膜增生性腎小球腎炎(MsPGN)屬于原發(fā)性腎小球疾病的一種類型，主要由彌漫性系膜細(xì)胞異常增生導(dǎo)致，加之患者腎臟細(xì)胞外基質(zhì)病理性聚集共同作用導(dǎo)致發(fā)病[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)，腎小球系膜細(xì)胞(HMC)凋亡與MsPGN的發(fā)病密切相關(guān)，這是因?yàn)樵贖MC細(xì)胞凋亡的過程中會(huì)大量消耗增殖細(xì)胞，加速致病進(jìn)程[3]。因此在MsPGN治療過程中，對(duì)系膜細(xì)胞的增殖進(jìn)行抑制、加快細(xì)胞凋亡，能對(duì)過度增殖性系膜細(xì)胞進(jìn)行消除，獲得治療效果。相關(guān)研究顯示，1，25(OH)2D3能抑制HMC增殖速度，加速凋亡，但其具體機(jī)制仍未闡明[4]。Caspase蛋白因子在細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，其中Caspase-3活性能反映細(xì)胞凋亡程度。而表皮生長因子(EGF)對(duì)細(xì)胞體外增殖存在促進(jìn)作用[5]?；诖?，本研究對(duì)1，25(OH)2D3對(duì)腎小球系膜細(xì)胞凋亡相關(guān)因子表達(dá)的影響進(jìn)行分析，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)HMC細(xì)胞株：由武漢科技大學(xué)附屬普仁醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心提供，并經(jīng)免疫熒光實(shí)驗(yàn)、形態(tài)學(xué)觀察鑒定；(2)試藥與試劑：1，25(OH)2D3；Caspase-3活性檢測(cè)試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒(美國Sigma公司)；兔抗人Caspase-3單克隆抗體、p-Akt(磷酸化Akt)單克隆抗體、Caspase-8單克隆抗體、Caspase-9單克隆抗體(深圳華大基因研究院)；(3)儀器設(shè)備：T100型PCR 儀(美國Bio-Rad公司)、MCO-18AIC型CO2培養(yǎng)箱(日本SANYO)、Falcon 96孔懸浮細(xì)胞培養(yǎng)板(美國BD公司，貨號(hào) CM001923);低溫冰箱(日本 SANYO公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組： 2017年10月—2018年9月在武漢科技大學(xué)附屬普仁醫(yī)院腎內(nèi)科實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。選擇由鏈霉素100 mg/L、10% 胎牛血清(FBS)及青霉素100 U/ml組成的L-DMEM完全培養(yǎng)基實(shí)施HMC細(xì)胞株復(fù)蘇，在37℃飽和濕度的CO2(濃度為5%)培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。根據(jù)2×105/ml密度將對(duì)數(shù)期HMC接種在6孔板內(nèi)，待細(xì)胞徹底貼壁后，再于饑餓條件下持續(xù)培養(yǎng)24 h，分成A組(空白對(duì)照組)、B組(EGF組)、C組[1，25(OH)2D3組]、D組[EGF、1，25(OH)2D3聯(lián)合組]。其中A組于5%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，B組于培養(yǎng)基內(nèi)加入EGF(10 ng/ml)培養(yǎng)液，C組加入1，25(OH)2D3(10-8mol/L)培養(yǎng)液，D組加入EGF(10 ng/ml)培養(yǎng)液和1，25(OH)2D3(10-8mol/L)培養(yǎng)液。

1.2.2 Caspase-3蛋白活性檢測(cè)：4組經(jīng)48 h干預(yù)培養(yǎng)后，開展細(xì)胞裂解實(shí)驗(yàn)[6]，并經(jīng)BCA蛋白定量試劑盒對(duì)提取蛋白表達(dá)進(jìn)行測(cè)定，在96孔板底酶標(biāo)板內(nèi)準(zhǔn)確配置等量的反應(yīng)體系，其中包括緩沖液80 μl、Ac-DEVD-pNA 10 μl、待測(cè)樣品10 μl，混勻后孵育4 h。待顏色變化，測(cè)定吸光度值。

1.2.3 細(xì)胞凋亡相關(guān)因子測(cè)定[7]：采用Western blot法對(duì)4組的Akt、p-Akt及Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9蛋白進(jìn)行測(cè)定。細(xì)胞裂解后，經(jīng)高速離心25 min，分離上清液；置入Loading Buffer煮沸10 min，促使蛋白變性。再分別開展上樣電泳及PVDF轉(zhuǎn)膜，用TBST溶液洗滌6次(每次5 min)，滴入ECL發(fā)光試劑，經(jīng)X線片曝光；Akt、p-Akt及Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9蛋白表達(dá)量以其與GAPDH的灰度比值表示。

1.2.4 Caspase mRNA水平測(cè)定[8]： 選擇熒光實(shí)時(shí)定量PCR法對(duì)Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9的mRNA表達(dá)進(jìn)行測(cè)定，選取4組細(xì)胞，應(yīng)用TRIzol法對(duì)RNA進(jìn)行提取，并經(jīng)反轉(zhuǎn)錄試劑盒使總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，所有操作全部參照說明書執(zhí)行，參照說明書設(shè)計(jì)Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9引物的上游、下游、引物長度。將PCR反應(yīng)體系設(shè)置為25 μl，在42℃環(huán)境下開展反轉(zhuǎn)錄30 min，99℃ 5 min，促使反轉(zhuǎn)錄酶的活性喪失。記錄基因擴(kuò)增Ct閾值，選擇2-△△ct計(jì)算各個(gè)mRNA基因表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1 Caspase-3蛋白活性比較 A組、B組、C組及D組Caspase-3蛋白活性分別為(0.890±0.004)、(0.362±0.005)、(1.376±0.010)、(1.001±0.002)； B組

2.2 p-Akt/Akt值比較 A組、B組、C組、D組的p-Akt/Akt比值分別為(0.240±0.005)、(0.599±0.026)、(0.047±0.004)、(0.439±0.060)；C組

圖1 4組HMC內(nèi)p-Akt、Akt蛋白的表達(dá)

2.3 Caspase蛋白表達(dá) Caspase-3及Caspase-9蛋白表達(dá)C組>D組>A組>B組(q=5.156、5.436、7.326；5.074、5.982、6.513,P均<0.01)； Caspase-8蛋白的表達(dá)4組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=0.165、0.178、0.204,P均>0.05)，見表1。

表1 4組Caspase蛋白表達(dá)情況

2.4 Caspase mRNA基因表達(dá) Caspase-3 mRNA、 Caspase-8 mRNA及Caspase-9 mRNA基因表達(dá)C組>A組>D組>B組(q=15.672、17.526、19.421，5.168、5.689、6.024，6.425、6.974、7.654，P均<0.01)，見表2。

表2 4組Caspase mRNA基因表達(dá)情況

3 討 論

原發(fā)性腎小球腎炎作為腎小球疾病常見類型，為引起晚期腎病的首要病因，多見于MsPGN。研究發(fā)現(xiàn)，MsPGN是一種呈彌漫性腎小球系膜細(xì)胞增生的系膜基質(zhì)增生性疾病，早期主要表現(xiàn)為系膜細(xì)胞數(shù)量異常增多[9-10]。因此，臨床認(rèn)為對(duì)系膜細(xì)胞增生進(jìn)行抑制，加快系膜細(xì)胞凋亡為控制MsPGN靶點(diǎn)，故探究HMC增生抑制原理，尋找誘導(dǎo)HMC凋亡藥物對(duì)于治療腎小球腎炎就顯得尤為重要[11]。研究顯示，B組細(xì)胞的凋亡機(jī)制復(fù)雜多變，實(shí)驗(yàn)中可以從細(xì)胞表面死亡受體內(nèi)質(zhì)網(wǎng)以及線粒體等信號(hào)途徑通路進(jìn)行探究[12]。Akt屬于蛋白激酶B，是人體細(xì)胞因子與其他下游蛋白刺激的重要組成部分，共同參與調(diào)節(jié)信號(hào)通路，于線粒體介導(dǎo)性內(nèi)源性凋亡通路內(nèi)起到主要作用[13]。本研究顯示，B組Caspase-3的活性低于A組，并且p-Akt/Akt比值高于A組，說明B組HMC相關(guān)凋亡活性顯著減弱，這可能與p-Akt/Akt比值升高存在相關(guān)性，而Akt磷酸化在加快HMC增殖及阻斷其凋亡過程中可能起到參與作用。結(jié)果顯示，于線粒體凋亡通路初期階段，熱休克蛋白(HSP)家族內(nèi)HSP27和Akt互相作用，能對(duì)凋亡發(fā)生進(jìn)行介導(dǎo)。Akt磷酸化能減弱凋亡信號(hào)的調(diào)節(jié)激酶1相關(guān)活性，通過抑制原癌基因蛋白質(zhì)與Akt磷酸化底物的結(jié)合，阻斷Caspase-9蛋白的活化，從而阻止細(xì)胞凋亡[14]?；罨疌aspase-3僅能于凋亡細(xì)胞內(nèi)檢出，故對(duì)Caspase-3活性改變進(jìn)行檢測(cè)可觀察到細(xì)胞早期凋亡，進(jìn)而反映細(xì)胞凋亡活性改變[15]。

Caspase起始蛋白可被活化成活性蛋白水解酶，對(duì)下游相關(guān)效應(yīng)凋亡蛋白酶進(jìn)行切割，而活化性效應(yīng)凋亡蛋白酶能對(duì)保持細(xì)胞結(jié)構(gòu)、活動(dòng)的相關(guān)蛋白實(shí)施裂解，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡，多由Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9誘導(dǎo)凋亡[16]。研究數(shù)據(jù)顯示，Caspase-3蛋白因子為細(xì)胞凋亡期間關(guān)鍵性終末剪切酶，于細(xì)胞程序性死亡過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[17]。本研究結(jié)果表明，A組Caspase-3及Caspase-9 mRNA的表達(dá)均高于B組，說明加快HMC增殖后，和凋亡有關(guān)的Caspase-3蛋白及Caspase-9蛋白的表達(dá)均減少，加之分析A組p-Akt/Akt比值低于B組，認(rèn)為HMC增殖后，能經(jīng)Akt磷酸化減少Caspase-3蛋白、Caspase-9蛋白表達(dá)，進(jìn)而對(duì)細(xì)胞凋亡過程進(jìn)行抑制。細(xì)胞因子于凋亡的3條途徑內(nèi)，Akt為線粒體介導(dǎo)性凋亡通路的主要交匯點(diǎn)，能經(jīng)磷酸化或與凋亡相關(guān)因子互相作用對(duì)細(xì)胞凋亡進(jìn)行調(diào)節(jié)[18]。Caspase-8是死亡受體途徑的主要啟動(dòng)因子，在對(duì)其活化誘導(dǎo)后，能對(duì)其下游相關(guān)同源酶進(jìn)行進(jìn)一步鏈?zhǔn)剿?，后將其效?yīng)物Caspase-3的生物效應(yīng)激活，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)Caspase對(duì)細(xì)胞分化存在促進(jìn)作用，可對(duì)細(xì)胞自噬進(jìn)行調(diào)節(jié)，加速細(xì)胞遷移。

1，25(OH)2D3是維生素D3主要生物活性形式，作為類固醇激素能調(diào)節(jié)鈣磷、腎素血管緊張素釋放、免疫系統(tǒng)、胰島素分泌、神經(jīng)系統(tǒng)功能。相關(guān)研究顯示，1，25(OH)2D3能阻斷細(xì)胞增生、加快細(xì)胞凋亡，降低系統(tǒng)性硬化癥及糖尿病等相關(guān)慢性疾病出現(xiàn)風(fēng)險(xiǎn)[19]。本研究結(jié)果表明，A組Caspase-3蛋白活性低于C組、D組，且B組Caspase-3蛋白活性低于D組；說明1，25(OH)2D3干預(yù)治療后能增強(qiáng)正常的HMC凋亡活性，且能增強(qiáng)增殖后HMC相關(guān)凋亡活性，提示1，25(OH)2D3能加快HMC凋亡。同時(shí)，本結(jié)果顯示，A組p-Akt/Akt比值高于C組，Caspase-3、Caspase-9 mRNA的表達(dá)均低于C組；說明1，25(OH)2D3能經(jīng)阻斷Akt磷酸化，使Caspase-3、Caspase-9 mRNA表達(dá)上調(diào)，增加HMC凋亡活性，加快HMC凋亡。而B組p-Akt/Akt比值高于D組；說明1，25(OH)2D3能增強(qiáng)增殖后HMC的凋亡活性，分析原因可能與阻斷Akt磷酸化，使Caspase-3、Caspase-9 mRNA表達(dá)上調(diào)存在相關(guān)性[20]。

綜上所述，1，25(OH)2D3可使增殖后HMC相關(guān)凋亡活性增強(qiáng)，通過抑制Akt磷酸化，上調(diào)Caspase-3蛋白及Caspase-9蛋白表達(dá)，從而增強(qiáng)HMC凋亡活性，加速凋亡進(jìn)程。

利益沖突：無

作者貢獻(xiàn)聲明

唐小鐵:研究方案設(shè)計(jì)，整理資料、分析資料、撰寫論文；徐潔：收集整理資料，參考書籍查找；王麗媛：收集整理資料，分析數(shù)據(jù)，圖表設(shè)計(jì)；于洋：修改論文；崔學(xué)彬、孫維言：收集資料