楊豐銘，楊 武

(東北師范大學(xué) 環(huán)境學(xué)院，長(zhǎng)春 130024)

氧化石墨烯(GO)是石墨烯基納米材料中較為典型的一種，其優(yōu)異的性質(zhì)在新能源、電子信息、生物醫(yī)藥、環(huán)境保護(hù)等領(lǐng)域都有巨大的應(yīng)用潛力[1]。然而GO在生產(chǎn)、運(yùn)輸、使用和廢棄過(guò)程中將會(huì)不可避免地進(jìn)入到城市污水處理系統(tǒng)[2]，目前城市污水處理系統(tǒng)主要依賴于操作簡(jiǎn)便的活性污泥法，因此，探究GO對(duì)活性污泥及污水處理效果的影響至關(guān)重要。

GO的抗菌性已被廣泛證實(shí)[3]，研究表明，其對(duì)細(xì)菌的毒性作用主要表現(xiàn)為對(duì)細(xì)胞膜的破壞以及氧化脅迫作用[4]，所以，GO對(duì)活性污泥微生物也必然存在一定的影響。現(xiàn)有關(guān)于GO細(xì)菌毒性的研究大多針對(duì)單一菌種，對(duì)活性污泥系統(tǒng)中微生物的毒性研究主要集中于高濃度的短期暴露影響，與現(xiàn)實(shí)情況中的低濃度、長(zhǎng)期暴露環(huán)境區(qū)別較大。因此，探究GO長(zhǎng)期暴露對(duì)SBR性能和微生物群落結(jié)構(gòu)的影響能為污水廠處理石墨烯基納米材料污染物提供科學(xué)依據(jù)，進(jìn)而更加有效地處理各類突發(fā)情況。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

實(shí)驗(yàn)用水為人工配制的模擬生活污水。模擬廢水組成：CH3COONa (512 mg/L)、NH3Cl(100mg/L)、KH2PO4﹒H2O(60mg/L)及濃縮微量元素液；實(shí)驗(yàn)廢水的水質(zhì)指標(biāo)為 COD 400 mg/L，氨氮(NH4+-N)25 mg/L，總磷(TP)10 mg/L，pH 為 7.0～7.5。微量元素包括：MgSO4·7H2O(5. 07 mg/L)，MnSO4·4H2O(0. 31 mg/L)，F(xiàn)eSO4·7H2O(2. 49 mg/L)，CuSO4(0. 25 mg/L)，Na2MoO4·2H2O(1. 26 mg/L)，ZnSO4·7H2O(0. 44 mg/L)，NaCl(0. 25 mg/L)，CaSO4·2H2O (0. 43 mg/L)，CoCl2·6H2O(0. 41 mg/L)，EDTA(1. 88 mg/L)。實(shí)驗(yàn)所用儀器為：磁力加熱攪拌器、電磁式空氣泵、蠕動(dòng)泵、電熱鼓風(fēng)干燥箱、電子天平、超聲波清洗器、掃描電鏡、紫外分光光度計(jì)、pH計(jì)、電子萬(wàn)用爐。接種污泥取自長(zhǎng)春市北郊污水處理廠好氧池活性污泥。

1.2 實(shí)驗(yàn)裝置

實(shí)驗(yàn)裝置為4個(gè)SBR反應(yīng)器，外徑11cm，內(nèi)徑10cm，有效容積2L,排水體積1L。反應(yīng)器設(shè)有進(jìn)水口、出水口、排泥口、曝氣頭和攪拌器。調(diào)節(jié)溫度為22℃±3℃、pH值為7.6～8.0、溶解氧為3～3.5mg/L。SBR反應(yīng)器運(yùn)行周期為8h，進(jìn)水10min，厭氧攪拌120 min，曝氣210min，靜置沉降130min，出水10min。實(shí)驗(yàn)裝置示意圖如圖1所示。

1-曝氣泵；2-氣體流量計(jì)；3-曝氣頭；4-磁力攪拌器；5-進(jìn)水口；6-出水口；7-排泥口；8-蠕動(dòng)泵；9-進(jìn)水箱圖1 實(shí)驗(yàn)裝置示意圖

1.3 實(shí)驗(yàn)過(guò)程及采樣

反應(yīng)器運(yùn)行45d，在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前對(duì)活性污泥進(jìn)行馴化，在脫氮除磷性能穩(wěn)定后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。在4個(gè)反應(yīng)器中加入GO，使反應(yīng)器中GO濃度為0mg/L、1mg/L、5mg/L、10mg/L。根據(jù)出水和排泥所損失的GO量，每天添加一定量的GO。反應(yīng)器每天運(yùn)行3個(gè)周期，每2d選取固定時(shí)間對(duì)各反應(yīng)器出水取樣。

1.4 水質(zhì)指標(biāo)分析方法

各反應(yīng)器出水用0.45 um的水系濾膜濾后的NH4+-N、TN、TP均采用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定。COD、PH、DO均采用哈納檢測(cè)儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.5 高通量測(cè)序方法

本文中污泥樣品的測(cè)序工作由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。根據(jù)E.Z.N.A.? soil試劑盒 (Omega Bio-tek, Norcross, GA, U.S.)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行總DNA抽提，DNA濃度和純度利用NanoDrop2000進(jìn)行檢測(cè)，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA提取質(zhì)量；用338F(5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’)和806R(5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’) 引物對(duì)V3-V4可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。利用Illumina公司的Miseq PE300平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。原始測(cè)序序列使用Trimmomatic 軟件質(zhì)控，使用FLASH軟件進(jìn)行拼接。使用的UPARSE軟件(version 7.1) ，根據(jù)97%的相似度對(duì)序列進(jìn)行OTU聚類；使用UCHIME軟件剔除嵌合體。

圖2 GO對(duì)COD去除的影響

2 結(jié)果與討論

2.1 GO對(duì)SBR系統(tǒng)性能的長(zhǎng)期影響

各反應(yīng)器出水中COD濃度如圖2所示。進(jìn)水COD約為400mg/L,在45d的運(yùn)行時(shí)間里，控制組的COD平均去除率達(dá)到95.1%。1mg/L GO對(duì)COD的去除影響并不明顯；在11d時(shí)，5mg/L GO組的出水COD上升到42mg/L，去除率下降到89.5%；在21d時(shí)，出水COD達(dá)到最高，濃度為67mg/L,去除率下降到83.3%；21d后，出水COD濃度有所下降，但平均去除率仍在89%以下。10mg/L GO組的出水COD高于控制組，最高時(shí)達(dá)到43mg/L,去除率為89.3%。

分析結(jié)果可知，5mg/L GO與10mg/L GO均對(duì)SBR系統(tǒng)的COD去除率產(chǎn)生了抑制，5mg/LGO對(duì)COD去除的抑制作用更強(qiáng)。污水生物處理去除COD主要是通過(guò)污泥微生物的生產(chǎn)代謝對(duì)污水中的有機(jī)物進(jìn)行利用，除此之外，還有可能被菌膠團(tuán)等物質(zhì)吸附后隨剩余污泥排出。因此，10mg/L GO對(duì)去除COD的抑制效果低于5mg/L GO的原因可能是GO對(duì)反應(yīng)器中的有機(jī)物產(chǎn)生了更好的吸附，一定程度上降低了COD。但顯而易見(jiàn)的是，GO對(duì)活性污泥微生物產(chǎn)生了一定的毒性，并且能夠降低有機(jī)物的去除效率。

4個(gè)反應(yīng)器中出水氨氮的濃度如圖3所示。進(jìn)水氨氮約為25mg/L，控制組的氨氮濃度去除率達(dá)到95.1%，1mg/L GO組的出水氨氮濃度與控制組的區(qū)別不大，在23d后略高于控制組。5mg/L GO與10mg/L GO對(duì)氨氮的去除有明顯的抑制，在29d前，10mg/L GO的出水氨氮濃度高于5mg/LGO組，隨后氨氮濃度有所下降并趨于平穩(wěn)，而5mg/L GO在29d后的氨氮濃度高于10mg/L GO。在出水氨氮趨于平穩(wěn)后，5mg/L GO組的氨氮平均去除率下降到70.5%，10mg/L GO組的平均去除率為70.2%。

通過(guò)實(shí)驗(yàn)結(jié)果推斷，GO能夠抑制硝化細(xì)菌的活性，削弱其將氨氮轉(zhuǎn)化為亞硝態(tài)氮的能力。其原因可能是由于GO的存在，使得硝化細(xì)菌生長(zhǎng)速率降低，從而抑制硝化作用。

圖3 GO對(duì)氨氮去除的影響

各反應(yīng)器總氮濃度如圖4所示。為期45d的實(shí)驗(yàn)期間，控制組與1mg/L GO組的總氮去除率區(qū)別不大，平均去除率分別為84.1%和83.4%。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后，5mg/LGO組與10mg/LGO組的出水總氮濃度逐漸上升，并在17d左右開(kāi)始趨于穩(wěn)定，且10mg/LGO對(duì)總氮去除的抑制程度高于5mg/LGO。二者在45d內(nèi)的總氮平均去除率分別下降至60.3%和54.1%。這一結(jié)果說(shuō)明，GO對(duì)脫氮細(xì)菌的生物活性存在抑制作用。

圖4 GO對(duì)總氮去除的影響

4個(gè)反應(yīng)器中出水TP濃度如圖5所示，進(jìn)水TP約為10mg/L，控制組與1mg/L GO組的總磷去除率均在90%以上，說(shuō)明低濃度GO對(duì)總磷的去除并無(wú)顯著影響。5mg/L GO組的出水TP濃度最高達(dá)到7.11mg/L，去除率下降28.9%，10mg/L GO組的出水TP濃度最高達(dá)到5.98mg/L,去除率為40.2%。由數(shù)據(jù)可知，GO長(zhǎng)期暴露后，5mg/L GO對(duì)總磷去除的抑制程度要略高于10mg/L GO。GO對(duì)除磷效率的抑制可能是由于其對(duì)活性污泥中除磷相關(guān)細(xì)菌活性的抑制，也有可能是由于微生物細(xì)胞因GO的毒性而破裂，使內(nèi)容物外泄從而導(dǎo)致總磷升高。

圖5 GO對(duì)總磷去除的影響

2.2 微生物群落多樣性分析

可以通過(guò)單樣本的多樣性(Alpha多樣性)分析來(lái)反映微生物群落的豐富度和多樣性，包括通過(guò)一系列統(tǒng)計(jì)學(xué)分析指數(shù)來(lái)估計(jì)環(huán)境群落的物種豐度和多樣性。OTU(Operational Taxonomic Units)是為了便于分析，人為給某一個(gè)分類單元(品系，屬，種、分組等)設(shè)置的統(tǒng)一標(biāo)志，再通過(guò)聚類操作，將序列按照彼此的相似性分歸為許多小組，一個(gè)小組就是一個(gè)OTU。反映群落豐富度的指數(shù)有sobs、chao、ace等；反映群落多樣性的指數(shù)有shannon、simpson、npshannon等；反映群落覆蓋度的指數(shù)為coverage。

本文列舉了具有代表性的OUT、shannon、simpson、coverage、chao指數(shù)。shannon 指數(shù)越大，simpson指數(shù)越小，說(shuō)明樣品生物多樣性越高；Chao指數(shù)越高，表明群落豐度越高；coverage數(shù)值越高，則樣本中序列被測(cè)出的概率越高。如表1所示，GO短期暴露的4個(gè)樣品中，5mg/L GO的OTU數(shù)量最低，而1mg/L GO與10mg/L GO的OTU數(shù)與空白組相差不大。短期暴露的4組樣品中，5mg/L GO的多樣性最低，物種豐度也較其他3組更低。而1mg/L GO的多樣性比空白組更高，可能是由于低濃度GO對(duì)微生物有促進(jìn)作用。

長(zhǎng)期暴露的4組樣品多樣性與物種豐度普遍低于短期暴露的樣品，其原因可能是實(shí)驗(yàn)室的配水與實(shí)際污水相比過(guò)于單一。但不同濃度的GO仍然對(duì)活性污泥的多樣性產(chǎn)生了不同的影響。與短期暴露時(shí)相同，5mg/L的OTU數(shù)最低(776)，比空白組(992)降低了約20%，1mg/L GO(791)與10mg/L GO(794)的OTU數(shù)也都低于空白組。4組樣品中，5mg/L GO的shannon、chao指數(shù)最低，simpson指數(shù)最高，物種多樣性與群落豐度最低。

總的來(lái)說(shuō)，5mg/L GO對(duì)物種多樣性的負(fù)面影響最大，而1mg/L GO 在短期暴露時(shí)會(huì)增加物種多樣性。

表1 Alpha多樣性分析

如圖6為污泥樣品在門(mén)水平的細(xì)菌豐度分布圖。由圖6可知，變形菌門(mén)(Proteobacteria)、擬桿菌門(mén)(Bacteriodetes)、放線菌門(mén)(Actinobacteria)綠灣菌門(mén)(Chloroflexi)為4種優(yōu)勢(shì)菌群。其中，變形菌門(mén)的含量占總菌數(shù)的43.2%～67.5%，在所有樣本中處于絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。說(shuō)明變形菌門(mén)的變形菌門(mén)細(xì)菌能夠很好地去除廢水中有機(jī)物，是污水處理廠常見(jiàn)的菌種，且均為革蘭氏陰性菌。長(zhǎng)期暴露的樣品與短期暴露相比，變形菌門(mén)的比例均有提升，而長(zhǎng)期暴露的5mg/L GO污泥樣品中，變形菌門(mén)的比例最高，達(dá)到了67.5%。

擬桿菌門(mén)在長(zhǎng)期暴露時(shí)也受到較大的的影響，擬桿菌門(mén)能促進(jìn)含氮物質(zhì)的利用、轉(zhuǎn)化類固醇生物和水解大分子物質(zhì)，對(duì)生物脫氮過(guò)程起到重要作用，是專性厭氧微生物。GO長(zhǎng)期暴露后，擬桿菌門(mén)的相對(duì)豐度有不同程度的上升，其中，10mg/L GO的擬桿菌豐度上升最高，達(dá)到34.5%。

GO長(zhǎng)期暴露的樣品中放線菌門(mén)與綠灣菌門(mén)的相對(duì)豐度普遍低于短期暴露的樣品。長(zhǎng)期暴露的4個(gè)樣品中，放線菌門(mén)相對(duì)豐度的下降幅度更為明顯，而綠灣菌門(mén)的相對(duì)豐度隨GO濃度的增加而下降。

圖6 門(mén)水平微生物群落分布

從暴露時(shí)間角度考慮，GO短期暴露與長(zhǎng)期暴露對(duì)污泥樣品門(mén)水平的菌群豐度分布會(huì)產(chǎn)生不同的影響，長(zhǎng)期暴露會(huì)增加變形菌門(mén)與擬桿菌門(mén)的豐度，降低擬桿菌門(mén)與放線菌門(mén)的豐度。從暴露濃度角度考慮，暴露45d時(shí)，5mg/L GO對(duì)變形菌門(mén)細(xì)菌促進(jìn)作如圖7所示。污泥樣品在屬水平上共檢測(cè)出47個(gè)屬，優(yōu)勢(shì)菌屬有Cytophagaceae、Thiothrix、Xanthomonadaceae、Acinetobacter、Candidatus Competibacter、 Anaerolineaceae、Saprospiraceae、Nitrosomonadaceae、Comamonadaceae、Nitrospira、Zoogloea、Saprospiraceae等。Cytophagaceae具有脫氮除磷的功能，是污泥樣品中最優(yōu)勢(shì)的菌屬。暴露45d時(shí)，5mg/L GO的Cytophagaceae菌屬豐度下降較為明顯，這可能是由于絲硫菌屬(Thiothrix)在競(jìng)爭(zhēng)中形成了較大優(yōu)勢(shì)，對(duì)Cytophagaceae菌產(chǎn)生了抑制。絲硫菌是引發(fā)污泥膨脹的主要菌屬，5mg/L GO樣品中絲硫菌豐度上升了23.3%，這也解釋了長(zhǎng)期暴露時(shí)反應(yīng)器的污泥沉降性下降的原因。Xanthomonadaceae細(xì)菌具有脫氮功能，經(jīng)過(guò)GO長(zhǎng)期暴露后，其相對(duì)豐度由空白組的7.5%降到了4.6%，且GO濃度越高下降幅度越大，這也可能是導(dǎo)致反應(yīng)器脫氮能力降低的原因。Nitrospira是典型的亞硝化細(xì)菌，Thauera菌具有反硝化作用，這兩種菌在長(zhǎng)期暴露后的相對(duì)豐度也都下降到1%以下。Tetrasphaera是除磷菌，該菌也在長(zhǎng)期暴露后豐度明顯減少。Anaerolineaceae具有反硝化功能，經(jīng)GO長(zhǎng)期暴露后豐度有一定程度的上升。

圖7 屬水平微生物群落分布

3 結(jié)論

(1)1mg/LGO對(duì)各水質(zhì)指標(biāo)沒(méi)有明顯影響，5mg/L GO與10mg/L GO則對(duì)COD、NH4+-N、TN、TP都有不同程度的抑制作用，其中，5mg/L GO對(duì)出水水質(zhì)的影響大于10mg/L GO；而GO對(duì)磷去除的抑制作用最強(qiáng)，GO濃度為5mg/L時(shí)，去除率最低時(shí)下降到28.9%。

(2)結(jié)果表明，高濃度GO會(huì)明顯降低微生物群落的豐富度和多樣性，其中，5mg/L GO的影響大于10mg/L GO，1mg/L GO在短期暴露時(shí)能夠提升物種多樣性。GO長(zhǎng)期暴露后變形菌門(mén)與擬桿菌門(mén)的種群豐度有明顯提升；5mg/L GO樣品中絲硫菌(Thiothrix)豐度上升到23.3%，這解釋了污泥膨脹及沉降性變差的原因；Xanthomonadaceae、Nitrospira、Thauera等與脫氮有關(guān)的功能性菌屬在高濃度GO暴露后豐度有明顯下降，這解釋了SBR反應(yīng)器脫氮能力下降的原因；除磷菌(Tetrasphaera)在GO長(zhǎng)期暴露后豐度也有所下降，這也對(duì)應(yīng)了GO對(duì)SBR反應(yīng)器除磷能力的抑制。