舒丹陽，謝瑾，崔春

(華南理工大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣州 510640)

草石蠶(StachyssieboldiiMiq.)又名螺絲菜、寶塔菜，屬于唇形科水蘇屬中能形成地下塊莖的栽培種，是一種野生植物資源[1,2]。草石蠶的主要活性成分為水蘇糖，其中水蘇糖含量高達12%～15%[3]。水蘇糖是天然存在的非還原性功能性低聚糖，具有增殖腸道益生菌、抑制腐敗菌生長，促進腸道蠕動的作用[4]，功能性低聚糖還能增強機體的免疫力，保護肝功能[5]。水蘇糖粘度高，羥基較多，持水能力強，可用作藥物賦形劑，也適用于沖劑、膠囊劑、片劑、口服液等劑型的醫(yī)藥品[6]。從天然原料中直接提取生產(chǎn)的水蘇糖產(chǎn)品純度較低，“雜糖”的存在降低了水蘇糖的功能特性，限制了它的使用。因此，開發(fā)一種制備高純水蘇糖的新技術(shù)對于開拓水蘇糖的應(yīng)用領(lǐng)域具有重要意義。本研究以草石蠶為原料，通過高溫提取獲得糖液，并以水蘇糖保留率和蔗糖降解率為指標，篩選出最佳的單菌發(fā)酵菌株；根據(jù)單菌對果糖、葡萄糖、蔗糖、水蘇糖等的利用規(guī)律，進行混菌發(fā)酵，分析、優(yōu)化混菌發(fā)酵工藝。本文旨在建立一條生產(chǎn)高純水蘇糖的工藝路線，為高純度水蘇糖的大規(guī)模生產(chǎn)提供了理論及實踐指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

干基草石蠶鮮品：采購于甘肅鎮(zhèn)原，清洗曬干后貯藏于干燥器中備用。干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)、鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus)、瑞士乳桿菌(Lactobacillushelveticus)：由華南理工大學(xué)食品蛋白質(zhì)實驗中心提供；米曲霉曲精(Aspergillusoryzae)滬釀3.042：石家莊市鼎鑫釀造食品科學(xué)研究所；黑曲霉曲精(Aspergillusniger)：濟寧玉園生物科技有限公司。

水蘇糖標品(≥98.0%)：購自美國Sigma公司；棉籽糖 (≥98.0%)：購自阿拉丁試劑公司；甘露三糖、蔗糖、葡萄糖、果糖：購自上海博奧生物技術(shù)有限公司；水蘇糖樣品(純度75.0%)：購自西安浩天生物工程有限公司；其他試劑：均為分析純。

1.2 實驗儀器

Waters系列高效液相色譜儀、2414-示差檢測器 美國Waters公司；Agilent-ZORBAX NH2柱(4.6 mm×250 mm，5 μm) 美國安捷倫科技有限公司；HH-8數(shù)顯電子恒溫水浴鍋 江蘇省金壇市宏華儀器廠；EL3002電子天平、AL204分析天平 梅特勒-托利多儀器有限公司；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；SXZ超凈工作臺 上海浦東躍新科學(xué)儀器廠；SCIENTZ-18N冷凍干燥機 寧波新芝生物科技股份有限公司；ZJP-A1430型霉菌培養(yǎng)箱 上海智誠分析儀器制造有限公司；GL-21M 高速冷凍離心機 長沙湘儀離心機儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 發(fā)酵純化工藝流程

干基草石蠶→復(fù)水處理→過濾取上清→單菌發(fā)酵篩選→混菌發(fā)酵優(yōu)化→精制純化→冷凍干燥。

取50 g干燥的草石蠶放入錐形瓶中，按一定的料液比加入去離子水，在常溫下分別靜置一定時間，在102 ℃下提取80 min。所得草石蠶提取液冷凍干燥后，測總糖含量和水蘇糖含量。

水溶性總糖的測定：采用苯酚-硫酸法[7]。

水蘇糖含量的測定：采用高效液相色譜法[8]，參照GB/T 22221—2008《食品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖的測定 高效液相色譜法》，略作修改。

1.3.2 單菌發(fā)酵篩選

米曲霉、黑曲霉的發(fā)酵培養(yǎng)：取100 mL提取液于250 mL錐形瓶中，密封，于121 ℃滅菌20 min，冷卻后分別加入0.01%的曲精，培養(yǎng)溫度30 ℃，分別于12，24，36，48 h取樣，所得樣品均在95 ℃沸水浴中加熱15 min滅霉，最后對樣品進行糖分分析。

3種乳桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)：取0.1 mL活化的菌液于100 mL滅菌過的草石蠶提取液中，30 ℃下間歇震蕩培養(yǎng)，分別于12，24，36，48 h取樣，在95 ℃沸水浴中加熱15 min滅菌，最后對不同發(fā)酵時間的發(fā)酵液進行糖分分析。

1.3.3 混菌發(fā)酵培養(yǎng)優(yōu)化

黑曲霉和干酪乳桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)：草石蠶經(jīng)高溫提取后，放置冷卻，按接種量0.01%或0.02%分別加入黑曲霉曲精和干酪乳桿菌種子液，同時加入0.05%蔗糖酶抑制劑EDTA。培養(yǎng)溫度30 ℃，分別于12，24，36，48 h取樣，所得樣品均在95 ℃沸水浴中加熱15 min進行滅菌，最后對樣品進行糖分分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 5種菌株不同發(fā)酵時間對提取液中水蘇糖、蔗糖、其他雜糖含量的影響

圖1 5種菌株發(fā)酵不同時間對水蘇糖和蔗糖濃度的影響Fig.1 Effects of fermentation time of five strains on the concentration of stachyose and sucrose

圖2 5種菌株發(fā)酵不同時間對雜糖濃度的影響Fig.2 Effects of fermentation time of five strains on the concentration of heterosaccharide

注：A為黑曲霉發(fā)酵；B為米曲霉發(fā)酵；C為干酪乳桿菌發(fā)酵； D為瑞士乳桿菌發(fā)酵；E為鼠李糖乳桿菌發(fā)酵。

由圖1和圖2可知，黑曲霉發(fā)酵24 h后，水蘇糖少部分降解生成甘露三糖，大部分蔗糖發(fā)生降解，水蘇糖的保留率為97.34%，蔗糖的降解率為45.06%。在發(fā)酵36 h后，水蘇糖的降解率增加，水蘇糖的保留率降為91.23%，同時蔗糖也被進一步降解消耗，降解率增加到65.59%。在發(fā)酵48 h后，蔗糖的降解率增加到69.44%，而水蘇糖的保留率僅有85.47%。

在水蘇糖和蔗糖的降解規(guī)律上，米曲霉和黑曲霉很相似，即隨著時間的延長，水蘇糖、蔗糖都不斷被降解，生成葡萄糖、果糖、甘露三糖等，米曲霉在發(fā)酵24 h后，水蘇糖的保留率僅為92.27%，蔗糖的降解率為48.10%，前24 h內(nèi)，米曲霉對蔗糖和水蘇糖的分解速度要高于黑曲霉。在發(fā)酵36 h后，水蘇糖的保留率降為88.56%，蔗糖的降解率增加到57.74%。

在前36 h內(nèi)，隨著干酪乳桿菌發(fā)酵時間的延長，蔗糖含量不斷下降，水蘇糖含量基本保持不變。在發(fā)酵36 h后，水蘇糖的保留率為94.33%，蔗糖的降解率為28.39%。在48 h后，水蘇糖的保留率降為89.54%，而蔗糖的降解率增加到49.08%。

隨著瑞士乳桿菌發(fā)酵時間的延長，水蘇糖緩慢地發(fā)生降解，而蔗糖被快速地降解生成葡萄糖和果糖。在發(fā)酵24 h 后，水蘇糖的保留率為95.89%，蔗糖的降解率為30.61%；在36 h 后，蔗糖進一步被降解，降解率增加到53.36%，少量水蘇糖被降解為甘露三糖，保留率為89.98%。

隨著發(fā)酵時間的延長，蔗糖和水蘇糖均緩慢地下降，鼠李糖乳桿菌能同時緩慢地代謝分解蔗糖和水蘇糖。在發(fā)酵36 h后，大部分蔗糖還被保留在發(fā)酵液中，水蘇糖的保留率為94.57%，而蔗糖的降解率僅有18.14%。

2.2 比較不同接種量菌株組合同步發(fā)酵過程中水蘇糖和蔗糖濃度變化

圖3 不同接種量菌株組合對水蘇糖和蔗糖濃度的影響Fig.3 Effects of different inoculation amount combinations on the content of stachyose and sucrose

注：A為0.01%黑曲霉+0.01%乳桿菌；B為0.02%黑曲霉+0.02%乳桿菌；C為0.02%黑曲霉+0.01%乳桿菌；D為0.01%黑曲霉+0.02%乳桿菌。

發(fā)酵初始，體系中均添加0.05% EDTA。由圖3可知，在4種不同接種量的混菌發(fā)酵組合中，以降解蔗糖降解率和水蘇糖保留率為參考指標，純化效果排序為：0.01%黑曲霉+0.01%乳桿菌>0.01%黑曲霉+0.02%乳桿菌>0.02%黑曲霉+0.01%乳桿菌>0.02%黑曲霉+0.02%乳桿菌。當2種菌株接種量都較大時，微生物在分解蔗糖和水蘇糖上的優(yōu)先順序不明顯，導(dǎo)致在相同發(fā)酵時間內(nèi)，更多的水蘇糖被降解為甘露三糖。同時，比較C和D的結(jié)果可知，當黑曲霉接種量較大時，發(fā)酵液中水蘇糖降解速度更快，所以C與D相比，D保留水蘇糖的效果會更好。在發(fā)酵36 h后，大部分的蔗糖基本被消耗，A、B、C和D的蔗糖降解率分別為88.03%、87.25%、87.44%、85.79%，其中0.01%黑曲霉+0.01%乳桿菌為最優(yōu)發(fā)酵菌株組合。

2.3 對比不同樣品的水蘇糖含量

將不同菌種發(fā)酵得到的水蘇糖發(fā)酵樣品經(jīng)過膜過濾、離子交換樹脂脫色、陰陽離子交換樹脂脫鹽處理后，冷凍干燥，測定水蘇糖濃度，結(jié)果見圖4和圖5。

圖4 雙菌種發(fā)酵對水蘇糖含量的影響Fig.4 Effect of double-strain fermentation on the content of stachyose

注：A為原樣純化；B為0.01%黑曲霉+0.01%乳桿菌發(fā)酵36 h純化；C為0.01%黑曲霉+0.02%乳桿菌發(fā)酵36 h純化；D為0.01%黑曲霉+0.01%乳桿菌發(fā)酵45 h純化；E為0.01%黑曲霉+0.01%乳桿菌36 h發(fā)酵樣。

圖5 0.01%黑曲霉+0.01%乳桿菌發(fā)酵36 h純化HPLC圖Fig.5 Purification HPLC chromatogram of 0.01%Aspergillusniger+0.01%Lactobacillus fermenting for 36 h

由圖5可知，0.01%黑曲霉+0.01%乳桿菌組合的水蘇糖含量略高于0.01%黑曲霉+0.02%乳桿菌組合，發(fā)酵36 h優(yōu)于48 h。0.01%黑曲霉+0.01%乳桿菌混菌組合發(fā)酵36 h后，進行離心過濾、活性炭脫色、10 kD膜包過濾，使用D001和D301樹脂床串聯(lián)離子交換柱脫鹽，冷凍干燥后，最終產(chǎn)品水蘇糖含量高達78.13%。

3 結(jié)論

黑曲霉發(fā)酵36 h后，水蘇糖的保留率為91.23%，蔗糖的降解率為65.59%，但黑曲霉對果糖的利用效果較差。與黑曲霉相比，米曲霉純化水蘇糖的潛力較低。干酪乳桿菌、瑞士乳桿菌、鼠李糖乳桿菌都較難發(fā)酵水蘇糖。其中瑞士乳桿菌消除蔗糖的能力最強，鼠李糖乳桿菌降解蔗糖的能力最差，然而瑞士乳桿菌不能有效利用果糖易造成果糖累積。干酪乳桿菌在發(fā)酵36 h后，水蘇糖的保留率為94.33%，蔗糖的降解率為28.39%。干酪乳桿菌能快速消耗果糖，保留水蘇糖，但降解蔗糖能力較差。黑曲霉降解蔗糖的能力較強，但消耗果糖的能力較差。

混菌發(fā)酵純化水蘇糖的效果要優(yōu)于單菌發(fā)酵，接種量最優(yōu)的混菌發(fā)酵組合為0.01%黑曲霉+0.01%乳桿菌。通過添加蔗糖酶抑制劑EDTA二鈉可使微生物水解糖的速度和消耗單糖的速度處于平衡狀態(tài)，減緩水蘇糖的降解速度。0.01%黑曲霉+0.01%乳桿菌混菌組合發(fā)酵36 h后，進行離心過濾、活性炭脫色、10 kD膜包過濾，使用D001和D301樹脂床串聯(lián)離子交換柱脫鹽，冷凍干燥后，樣品水蘇糖含量高達78.13%。