黎偉，王宋平

（1.成都市溫江區(qū)人民醫(yī)院 呼吸科，四川 成都 611130；2.西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院呼吸一科，四川 瀘州 646000）

肺鱗狀細胞癌是常見的胸部惡性腫瘤之一，尤其在長期吸煙人群中更為高發(fā)[1]。肺鱗狀細胞癌癥狀隱匿，病程進展快，許多患者就診時已無根治手術機會，故患者術后生存率較低[2]。微小核糖核苷酸（MicroRNA,miRNA）是一種長度較短的單鏈RNA，它能夠通過結合miRNA 的3'-端非編碼區(qū)來抑制靶基因的表達[3]。例如，miR-21 在肺癌中呈高表達且這部分患者預后較差[4]；PDCD4 被證實是miR-21[5]；Hedgehog 通路的活性則可以被miR-218 副性調(diào)節(jié)，進而逆轉(zhuǎn)肺癌細胞多重耐藥表型[6]。目前研究表明，miR-577 能夠調(diào)控多種腫瘤進展[7]。為研究miR-577 在肺癌中的生物學功能，本研究利用慢病毒為載體制備miR-577 過表達細胞模型。本研究旨在探索miR-577 對肺癌侵襲的影響，以期為miR-577 成為肺癌分子治療靶標提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取2013年1月—2016年12月成都市溫江區(qū)人民醫(yī)院收治的肺鱗狀細胞癌患者60 例。其中，男性40 例，女性20 例，取其癌組織和對應癌旁組織。

1.2 細胞來源及主要試劑

NCI-H520 細胞（ATCC ? HTB-182TM）由本院實驗室保存；miR-577 慢病毒顆粒（病毒載體類型：psi-LVRH1GP）購自廣州復能基因公司，miR-577及U6 引物購自廣州銳博生物科技有限公司，Trizol試 劑（15596026）、RT-PCR 試 劑 盒（Super Script ? One-Step RT-PCR System with Platinum ? Taq DNA Polymerase,10928042）及qRT-PCR 試劑盒（DyNAmo Flash SYBR Green qPCR Kit,F415L） 均 購 自 美 國Invitrogen 公司，CCK-8 試劑盒、細胞凋亡檢測試劑盒（E606336）購自上海生工生物工程有限公司，兔抗人β-catenin 多克隆抗體（ab16051）、MMP-7 抗體（ab5706）及鼠抗人β-actin 單克隆抗體（ab8226）均購自美國Abcam 公司。

1.3 qRT-PCR

標本及細胞RNA 由Trizol 試劑提取。qRT-PCR 條件設定為：逆轉(zhuǎn)錄50℃預變性30 min，94℃變性2 min，循環(huán)1 次；94℃預變性15 s，60℃退火30 s，68℃延伸3 min，循環(huán)40 次；72℃再延伸10 min，循環(huán)1 次。通 過2-△△Ct法 檢 測miR-577 及β-catenin mRNA 的 相對含量。β-catenin 及內(nèi)參GAPDH 引物由上海生工生物工程有限公司合成。β-catenin 引物序列：正向引物5'-CATCCGGAAGAAACTGGT-3'；反向引物5'-TC CCACAAAGCCAACTC-3'。GAPDH 引物序列：正向引物5'-TACTAGCGGTTTTACGGGCG-3'；反向引物5'-T CGAACAGGAGGAGCAGAGAGCGA-3'。

1.4 細胞培養(yǎng)及慢病毒感染

NCI-H520 細胞于適宜條件下培養(yǎng)至穩(wěn)定傳代。將NCI-H520 細胞按適宜密度接種6 孔板。實驗分組：miR-577 組：每孔加入1 ml miR-577 慢病毒上清液、2 ml 完全培養(yǎng)基及15 μg ploybrene；miR-NC 組：每孔加入1 ml miR-control 慢病毒上清液、2 ml 完全培養(yǎng)基及15 μg ploybrene。轉(zhuǎn)染48 h 后，使用含2 μg/ml Puromycin 篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞。

1.5 劃痕愈合試驗

NCI-H520 鋪滿6 孔板。100 μl 的槍頭制作劃痕，以無血清DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞48 h。倒置白光顯微鏡下觀察細胞遷移，以Image J 軟件定量統(tǒng)計遷移距離。以細胞遷移48 h 后剩余空白距離與原始測量之比，即剩余距離百分比表示細胞遷移能力。

1.6 Transwell 侵襲小室

以無血清培養(yǎng)基接種NCI-H520細胞2×104個/孔，小室內(nèi)加入750 μl 有血清正常培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h 后移除培養(yǎng)基，甲醛固定細胞，結晶紫染色。倒置白光顯微鏡下觀察細胞侵襲，計數(shù)侵襲細胞數(shù)目。

1.7 Western blotting

RIPA 試劑提取細胞總蛋白，凝膠垂直電泳分離蛋白，70 V 恒壓轉(zhuǎn)膜150 min，5%牛血清白蛋白封閉1 h 后將條帶孵育于1 ∶1 000 稀釋的相應一抗中。4℃過夜后，使用1 ∶5 000 稀釋的辣根過氧化物酶標記二抗孵育條帶1 h。ECL 法曝光條帶。

1.8 免疫組織化學染色

組織切片常規(guī)預處理后滴加1 ∶100 稀釋的一抗，4℃孵育過夜。清洗殘余一抗后，使用HRP 標記的二抗結合對應的一抗，DAB 法顯色。按如下方法計算IHC 評分：＜5%，0 分；5%～15%，1 分；16%～ 50%，2 分；51%～75%，3 分；＞75%，4 分。

1.9 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 13.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，比較采用t檢驗，計數(shù)資料以例（%）表示，比較采用χ2檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 miR-577 在肺鱗狀細胞癌組織中的表達

肺鱗狀細胞癌組織中miR-577的表達水平與癌旁組織比較，差異有統(tǒng)計學意義（t=2.319，P=0.027），癌組織中miR-577 的表達水平（0.421±0.073）低于癌旁組織中miR-577 的表達水平（1.1398±0.086）。

2.2 miR-577 表達與肺鱗狀細胞癌臨床病理特征的關系

以肺癌組織中miR-577 在肺癌組織中平均表達水平為界值，分為miR-577 高表達及低表達。結果表明，淋巴結轉(zhuǎn)移較多出現(xiàn)在miR-577 低表達的肺癌組織中，提示miR-577可能與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移相關。見表1。

2.3 miR-577 抑制NCI-H520 細胞遷移及侵襲

如圖1所見，miR-577 組細胞內(nèi)miR-577 表達水平與miR-NC 組比較，差異有統(tǒng)計學意義（t=11.285，P=0.008），miR-577 組細胞miR-577 表達升高。細胞劃痕愈合試驗檢測得知，過表達miR-577 在體外降低NCI-H520 細胞的遷移能力，差異有統(tǒng)計學意義（t=7.423，P=0.019）。遷移與侵襲是腫瘤轉(zhuǎn)移的2 個微觀過程，因此本研究還通過transwell 小室檢測細胞侵襲的變化。過表達miR-577 表達后，miR-577 組肺鱗狀細胞癌NCI-H520 細胞侵襲數(shù)量較miR-NC 組降低，差異有統(tǒng)計學意義（t=6.742，P=0.023）。

表1 肺鱗狀細胞癌臨床病理特征與miR-577 表達的關系 （n =60，例）

圖1 過表達miR-577 表達對肺鱗狀細胞癌 NCI-H520 細胞遷移、侵襲的影響

2.4 過表達miR-577 對下游靶點β-catenin 的調(diào)控作用

與miR-NC 組比較，miR-577 組的NCI-H520 細胞內(nèi)β-catenin mRNA（t=8.531，P=0.017）及蛋白（t= 9.781，P=0.015）水平均下降。在miR-577 表達量相對較高的肺癌組織中，β-catenin 的免疫組織化學SP 染色強度降低，差異有統(tǒng)計學意義（t=2.211，P= 0.032）。此外，有結果顯示，基質(zhì)金屬蛋白酶7（matrix metallopeptidase 7,MMP-7）是β-catenin 調(diào)節(jié)腫瘤侵襲能力的效應基因之一。過表達miR-577 后細胞內(nèi)MMP-7 的mRNA（t=4.808，P=0.036）及蛋白（t=5.117，P=0.029）的表達水平下降。見圖2。

圖2 過表達miR-577 對NCI-H520 細胞內(nèi)β-catenin 及MMP-7 表達的影響

3 討論

miR-577 作為一種新發(fā)現(xiàn)microRNA，其在不同類型的惡性腫瘤中的表達情況并不完全清楚[8]。本研究中，通過qRT-PCR 檢測得知，肺鱗狀細胞癌組織中miR-577 的表達水平呈降低趨勢。這表明在miR-577在肺鱗狀細胞癌中可能是一種抑癌因子。為驗證這一假設，本研究設計了一系列體外細胞學實驗。通過實驗結果證實，miR-577 具有削弱腫瘤細胞遷移及侵襲的效果。另外，最新文獻也指出，miR-577 也能夠抑制腫瘤細胞的增殖并促進細胞凋亡[9]。說明miR-577的抗腫瘤效應具有生物多樣性，值得在今后的工作中進一步深入研究。

miRNA 能夠通過結合靶基因3'-UTR 區(qū)而發(fā)揮負向調(diào)控作用[10]。通過生物信息學檢索分析發(fā)現(xiàn)，β-catenin 的mRNA 存在miR-577 的結合位點。既往研究[11]表明，β-catenin 在肺鱗狀細胞癌內(nèi)高表達且具有促癌作用，其可能是miR-577 的潛在靶點之一。通過qRT-PCR 及Western blotting 實驗發(fā)現(xiàn)，過表達miR-577 在體外的確能下調(diào)β-catenin 的表達水平，進一步通過免疫組織化學染色發(fā)現(xiàn)高表達miR-577 的腫瘤組織中β-catenin 的表達也有所降低?；|(zhì)金屬蛋白酶對腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移均具有促進作用[12-13]。而肺癌侵襲轉(zhuǎn)移表型的改變中是否涉及MMP-7 表達的變化尚不清楚。β-catenin 是一種重要的癌性轉(zhuǎn)錄因子[14-15]，研究指出，MMP-7 的轉(zhuǎn)錄可能受到β-catenin 的調(diào)節(jié)[16]。本研究中，在過表達miR-577 后發(fā)現(xiàn)，在下調(diào)β-catenin 表達水平的同時MMP-7 的表達水平也出現(xiàn)下降，提示miR-577 的抑制腫瘤遷移及侵襲作用可能是通過抑制β-catenin/MMP-7 信號通路活化實現(xiàn)。

關于microRNA 在腫瘤中一場表達的機制，目前認為主要與兩方面因素有關：①長鏈非編碼RNA 作為分子海綿結合miRNA，導致miRNA 的表達下降，并失去生物活性。例如，具有抑癌作用的miR-504 在肝癌中表達下調(diào)，其原因正是由于長鏈非編碼RNA KCNQ1OT1 在HCC 中的高表達導致大量miR-504 下調(diào)。②第2 種潛在的機制是miRNA 表達的表觀遺傳學調(diào)控。如miR-483-3p 因啟動子區(qū)域的甲基化而沉默，miR-483-3p 下調(diào)后導致非小細胞肺癌對吉非替尼的化療抵抗。對miR-577 在肺癌中異常表達的具體機制尚需要進一步研究。

綜上所述，miR-577 在肺鱗狀細胞癌中低表達，上調(diào)miR-577 可能通過抑制β-catenin/MMP-7 信號通路的活化來實現(xiàn)的。