董壽堂， 楊 嬌， 張旭強(qiáng)， 胡 燕， 楊紅芹

(1. 保山中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校, 云南 保山 678000； 2. 大理大學(xué)藥學(xué)與化學(xué)院, 云南 大理 671000)

紫皮石斛(Dendrobium devoninum Paxt)又名齒瓣石斛、紫皮蘭、大黃草，為蘭科石斛屬植物，其性味甘、微寒，具有養(yǎng)胃生津、滋陰除熱功效，主要用于陰傷津虧、口干煩渴、食少干嘔、病后虛熱、目暗不明等[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)，紫皮石斛中含有多種氨基酸、聯(lián)芐類、菲類、微量元素、多糖等化學(xué)物質(zhì)，具有抗氧化、抗菌及增強(qiáng)免疫力的作用[3-8]。但目前人們主要研究紫皮石斛的栽培、種植，而對紫皮石斛的現(xiàn)代藥學(xué)研究比較少，導(dǎo)致紫皮石斛的研究開發(fā)受到一定的限制。本文以紫皮石斛的功效、化學(xué)成分、藥理作用為理論依據(jù)，并結(jié)合保健食品研制思路與方法，探究紫皮石斛的抗體力疲勞作用，為進(jìn)一步研究和開發(fā)紫皮石斛奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

紫皮石斛購于云南省保山市龍陵天和土特產(chǎn)商貿(mào)發(fā)展有限公司，60%乙醇購于云南省大理州博源化工廠，人參皂苷購于西安普瑞斯生物工程有限公司，小鼠乳酸(Lactate)、小鼠尿素氮(blood uria nitrogen, BUN)、小鼠肝糖原(Glycogen)Elisa試劑盒均購于上海潤裕生物科技有限公司。

1.2 儀器與材料

電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科技儀器有限公司)，YF-150高速中藥粉碎機(jī)(浙江省瑞安市永歷制藥機(jī)械有限公司)，RE-5220旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)，PB153-S精密分析天平(瑞士METTLERTOLEDO)，EL304型電子分析天平(上海梅特勒-托利多儀器有限公司)，DY89-Ⅱ型電動玻璃勻漿機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)，TL-16R型臺式高速冷凍離心機(jī)(上海市離心機(jī)機(jī)械研究所)，BCD-539WT冰箱(中國海爾集團(tuán))，Milli-Q超純水機(jī)(Millipore，USA)，3-15臺式高速離心機(jī)(美國sigma)，Synergy HT多功能酶標(biāo)儀(美國BioTek)，311-CO2恒溫培養(yǎng)箱(美國Thermo Scientific Forma)，移液器(美國 Thermo Fisher Scientific)，鉛絲，溫度計。

1.3 動物

昆明種小鼠，雄性，體重(18～22)g，購于湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司，合格證號：SCXK(湘)2013-0004。

1.4 紫皮石斛的提取

取適量紫皮石斛，于55℃干燥箱中干燥6 h，經(jīng)粉碎機(jī)粉碎后，電子天平稱重為8664.0 g，用60%乙醇冷浸5次，每次3 d，然后合并濾液，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮，得到浸膏 2570.4 g，提取率為29.67%，其濃度為2.81 g/ml，即1 g相當(dāng)于 3.37 g的生藥。置于4℃下密封保存，備用。

1.5 紫皮石斛給藥劑量的確定及其溶液的制備[9]

根據(jù)小鼠對紫皮石斛最大耐受量為52.56 g/kg·d-1生藥，并依據(jù)《中藥藥理研究方法學(xué)》所述，紫皮石斛的安全劑量為最大耐受量的1/3，即為本實驗的中劑量17.52 g/kg·d-1生藥，然后以二倍比法得到高劑量35.04 g/kg·d-1生藥及低劑量8.76 g/kg·d-1生藥。以給藥體積0.2 ml/10 g，紫皮石斛高、中、低劑量的濃度應(yīng)分別為1.752 g/ml生藥、 0.876 g/ml生藥、0.438 g/ml生藥。

1.6 溶液的制備

1.6.1 人參皂苷溶液制備 以給藥劑量200 mg/kg·d-1、給藥體積0.2 ml/10 g為依據(jù)，即應(yīng)配制成1%的溶液。取 81.43%人參皂苷適量，用蒸餾水配制成所需濃度。

1.6.2 0.01mol/L的PBS配制 分別精密稱取KH2PO40.27 g、Na2HPO41.42 g、NaCL 8 g、KCL 0.2 g，加去離子水約800 ml充分?jǐn)嚢枞芙夂?，用鹽酸或氫氧化鈉將pH值調(diào)至 7.2～7.4，然后定容到1000 ml，備用。

1.7 動物分組及給藥

取雄性昆明種小鼠50只，適應(yīng)環(huán)境3 d，按體重隨機(jī)分成5組，每組10只，分別為空白對照組，人參皂苷組，紫皮石斛高、中、低劑量組?？瞻讓M給予等體積的生理鹽水，人參皂苷組給藥劑量為200 mg/kg·d-1，紫皮石斛高、中、低劑量組給藥劑量分別為35.04 g/kg·d-1生藥、17.52 g/kg·d-1生藥、8.76 g/kg·d-1生藥，每天灌胃1次，連續(xù)15 d。

1.8 小鼠負(fù)重游泳實驗

各組同一小鼠于末次給藥30 min后，將相當(dāng)于小鼠體重5%的負(fù)荷鉛絲系于1/3尾部，把小鼠放入水溫(25±0.5)℃，水深為30 cm水池(50 cm×50 cm×40 cm)中，然后進(jìn)行負(fù)重游泳。游泳期間如有弓腰停止、懸浮休息者，用玻璃棒刺激游動以防止偷懶。記錄小鼠從放入水池至小鼠沉入水10 s未能浮在水面上的時間，即為小鼠負(fù)重力竭游泳時間。

1.9 小鼠血清尿素氮含量測定

各組同一小鼠于末次給藥30 min后，將小鼠放入溫度為30℃的水池(50 cm×50 cm×40 cm)中不負(fù)重游泳90 min，休息30 min后摘眼球采血0.5 ml(不加抗凝劑)，置4℃冰箱約3 h，血凝固后2 000 r/min離心15 min，取血清備用。然后按照試劑盒說明書檢測血清尿素氮的含量。

1.10 小鼠血清乳酸含量測定

各組同一小鼠于末次給藥30 min后，將小鼠放入溫度為30℃的水池(50 cm×50 cm×40 cm)中不負(fù)重游泳10 min，休息20 min后摘眼球采血0.5 ml(不加抗凝劑)，置4℃冰箱中過夜后于1 000 g/min離心20 min，取血清備用。然后按照試劑盒說明書檢測血清乳酸的含量。

1.11 小鼠肝糖原含量測定

各組同一小鼠于末次給藥30 min后，頸椎脫臼處死動物，取肝臟經(jīng)生理鹽水漂洗后用濾紙吸干，精密稱取500 mg，加入PBS，用組織勻漿機(jī)勻漿制成10%漿液，以3 000 r/min離心20 min，取適量的上清液備用。然后按試劑盒說明書測定小鼠肝糖原的含量。

1.12 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 紫皮石斛對小鼠負(fù)重游泳的影響

與空白對照組比較，人參皂苷組、紫皮石斛高劑量組能明顯延長小鼠負(fù)重游泳的力竭時間，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，表1)。

GroupLoad swimming timeControl46.39±31.48Ginsenoside78.85±27.68*High dose76.91±34.61*Middle dose62.83±29.37Low dose66.27±37.77

*P<0.05vscontrol group

2.2 紫皮石斛對小鼠血清尿素氮和乳酸的影響

與空白對照組比較，人參皂苷組能明顯降低小鼠游泳后的血清尿素氮和乳酸含量，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，表2)。紫皮石斛各劑量組均能明顯降低小鼠游泳后的血清乳酸含量，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，P<0.01，表2)；紫皮石斛高劑量組及低劑量組能明顯降低小鼠游泳后的血清尿素氮含量，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，P<0.01，表2)。

GroupUrea nitrogen(mmol/L)Lactic acid(mg/L)Control2.97±0.300.72±0.29Ginsenoside2.35±0.41*0.38±0.11**High dose2.38±0.43*0.42±0.25**Middle dose2.61±0.240.42±0.24**Low dose2.49±0.16**0.47±0.16*

*P<0.05，**P<0.01vscontrol group

2.3 紫皮石斛對小鼠肝糖原的影響

與空白對照組比較，人參皂苷組、紫皮石斛高劑量組及中劑量組能明顯增加小鼠肝糖原的儲備量，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，P<0.01，表3)。

GroupLiver glycogenControl1.07±0.09Ginsenoside1.66±0.48*High dose2.10±0.70**Middle dose1.21±0.10*Low dose1.34±0.25

*P<0.05，**P<0.01vscontrol group

3 討論

紫皮石斛在云南龍陵有大量人工栽培，且具有質(zhì)量好的特點，故在2011年11月該縣被中國中藥協(xié)會授予“中國紫皮石斛之鄉(xiāng)”稱號，2012年“龍陵紫皮石斛”獲得國家工商行政管理總局頒發(fā)的《地理標(biāo)志證明商標(biāo)注冊》證書[2]。其在民間有廣泛應(yīng)用，常常將其當(dāng)作蔬菜、果汁、茶品、泡酒等藥食兩用來食用，并受到廣大民眾的喜愛。但近年來隨著紫皮石斛種植面積的擴(kuò)大，產(chǎn)量大于需求，導(dǎo)致紫皮石斛滯銷，價格低廉。為此，本實驗以紫皮石斛的功效、化學(xué)成分及藥理作用為理論依據(jù)，探究紫皮石斛的抗體力疲勞作用，從而提高紫皮石斛的社會價值和經(jīng)濟(jì)價值，為其產(chǎn)鏈的發(fā)展奠定基礎(chǔ)。

體力疲勞是復(fù)雜的生理變化過程，它與很多因素有關(guān)，如缺氧、能源物質(zhì)耗竭、代謝產(chǎn)物增加、免疫能力降低、內(nèi)分泌紊亂等等。目前公認(rèn)體力疲勞主要是由于機(jī)體能源物資耗竭及其代謝產(chǎn)物增加，引起內(nèi)環(huán)境功能紊亂，導(dǎo)致工作效率降低。糖原是機(jī)體主要的能源儲備物質(zhì)[10]。機(jī)體長時間劇烈運動時，主要依靠肌糖原、肝糖原的分解供能。長時間運動可造成糖原大量的消耗或耗竭，引起能量供應(yīng)不足, 誘發(fā)體力疲勞。因此，糖原儲備量可反映運動的程度和持續(xù)時間，可作為評價體力疲勞的一個敏感指標(biāo)[10-12]。當(dāng)機(jī)體持續(xù)長時間運動會導(dǎo)致能源物質(zhì)供應(yīng)不足，會誘發(fā)組織中蛋白質(zhì)分解來補(bǔ)充能量不足，蛋白質(zhì)分解會使體內(nèi)尿素氮生成增加，并與運動耐力成正相關(guān)。即尿素氮含量可反映運動耐力程度, 可作為評定體力疲勞的一個指標(biāo)[10-12]。在劇烈運動過程中，機(jī)體組織缺氧，糖酵解加快，乳酸生成增多，肌肉組織中pH值下降，從而降低肌肉收縮能力，引起體力疲勞。因此，乳酸水平可反映機(jī)體運動程度，可作為評價體力疲勞的一個重要指標(biāo)[10-12]。此外，結(jié)合《保健食品研制思路與方法》中抗疲勞功能評價的方法，通過測定小鼠負(fù)重力竭游泳時間及體內(nèi)血乳酸、血清尿素氮、肝糖原的含量，可判斷紫皮石斛是否具有抗體力疲勞的作用[10]。

實驗結(jié)果表明，紫皮石斛能明顯延長小鼠負(fù)重力竭游泳時間，增加肝糖原含量，并能降低血清乳酸、血清尿素氮含量，且具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。據(jù)《保健食品研制思路與方法》所述，凡是負(fù)重游泳實驗結(jié)果陽性，血乳酸、血清尿素氮、肝糖原3項生化指標(biāo)中任2項指標(biāo)陽性，可判定該受試樣品具有緩解疲勞的作用[13]。綜上所述，紫皮石斛具有抗體力疲勞作用，主要由于紫皮石斛增加肝糖原儲備，抑制糖酵解及蛋白質(zhì)分解，使體內(nèi)的乳酸及尿素氮生成減少，從而達(dá)到緩解體力疲勞的作用。